Următorul
conținut este furnizat
de MIT OpenCourseWare sub
o licență Creative Commons.
Informații suplimentare
despre licența noastră
și despre MIT OpenCourseWare
în general
sunt disponibile la ocw.mit.edu.
GEORGE CHURCH: OK.
Bine ai revenit.  Vom
trece printr-un
exemplu foarte specific de
studiu de asociere, ilustrând această
statistică extrem de importantă,
statistica chi-pătrat
în cel mai simplu caz.
Acest caz simplu va fi o
combinație cu o singură alele,
două alele și două posibile
rezultate fenotipice,
rezistența la HIV și
nonrezistența la HIV.
Deci, pentru a stabili acest
studiu de asociere, care
ar fi computațional, să
vorbim puțin
despre biologie aici.
Toți virușii trebuie să intre
în celulele tale cumva.
HIV are o serie de
proteine ​​de care se leagă
pe suprafața celulei dumneavoastră.
Aceste proteine ​​nu sunt...
nu sunt concepute pentru a lega HIV.
Ei fac altceva.
Acesta este într-o familie de
receptori de chemokine.
Acesta este implicat în
semnalizarea intracelulară
și, prin urmare, este un receptor în mod
normal pentru aceste chemokine.
Dar este și un
receptor pentru virus.
Și în populația umană,
așa cum am făcut aluzie mai devreme,
există cel puțin două
alele, două alele comune.
Una dintre ele, cea de sus
, CCR5 capitală,
are acest
cadru de lectură lung și deschis.
Și asta ai putea traduce
prin banda ta de perle pe
care ai scris-o pentru
setul de probleme.
Și secvențele de ADN
din mijloc aici
și secvența de proteine ​​derivate
din ea se află pe catena superioară.
Și aceasta este capitala CCR5.
Și mica delta sau
ștergerea Ccr5 este sub ea.
Ați blocat 32 de
perechi de baze, ceea ce nu este
un multiplu de interval de trei.
Și după cum știți
din ultima prelegere,
asta înseamnă că va fi
un alt cod genetic.
În fiecare punct din aval, acesta va
fi deplasat în cadru
și astfel veți obține un
set complet nou de aminoacizi
pentru întregul rest
al capătului carboxi.
Deci asta cu negru
aici... deci arătăm
aici în codul cu o singură literă
o pliere oarecum realistă
a... plierea schematică
a proteinei, arătând aici
disulfura între două cisteine.
Regiunea transmembranară,
avem aceste elice alfa hidrofobe
.
Și în cele din urmă, în
aminoacizii negri, capătul
C-terminal,
capătul proteinei
sunt toți substituiți în
acest mutant de ștergere.
Acum este suficient pentru a
provoca rezistență la virus.
Probabil are un anumit
efect asupra capacității sale de a
lega chemokinele sau de a reacționa
la ele într-un alt mod.
Și probabil, acest lucru nu este...
există un
efect dăunător despre care nu știm.
Dar, în orice caz,
putem evalua acest lucru.
Putem face un
test genetic pentru asta.
Și putem căuta în
populațiile umane
rezistența lor la HIV și
prezența fie a două
alele ale rezistenței, fie a
două alele ale celui susceptibil.
Acum te cam părăsesc
aici în asta.
Nu am făcut
studiul de asociere.
Chiar nu ar trebui să mă refer
la el ca fiind rezistent sau nu,
dar cred că
te ajută să-l vizualizezi.
Vom fi suficient de riguroși
în următorul slide.
Deci iată, dacă vreți,
alela mare, nu?
Este originalul.
Este alela neștersă.
Deci, atunci când faceți un
test PCR în care
amplificați cu doi primeri
în întreaga regiune care
ar putea fi șters
sau nu, veți avea tendința
de a obține un
produs de amplificare mare.
Primești sinteza
până când obții ceva
care are 403 perechi de baze.
Și este suficient de mult
încât să-l poți afișa
pe gel electroforetic
și migrează încet
pentru că este mare.
Dacă aveți un homozigot
pentru alela de ștergere,
nu o vom numi
încă alela de rezistență la HIV,
atunci veți obține un
produs PCR de 371 de perechi de baze.
Și dacă aveți
heterozigotul,
veți obține ambele, alela mare și
cea mică reprezentate
în acest test electroforetic.
Un test ADN foarte simplu, foarte robust,
bazat pe PCR.
Așa că acum să ne întrebăm dacă
o alelă sau cealaltă
este mai abundentă la persoanele
care sunt observate a fi
seropozitive sau seronegative.
Seropozitiv înseamnă
că au
anticorpi circulanți
în ser
care reacționează pozitiv
la virusul HIV.
Și deci nu este
neapărat, dar este asociat în mod obișnuit
cu
expunerea puternică la virusul HIV
și, prin urmare,
practic infectată.
Seronegativ înseamnă
că ești... este
un indiciu
că ești rezistent.
Acum am putea face acest lucru ca
o matrice de două câte două aici
de alele versus
rezultate, sau am
putea face asta ca o matrice de
trei câte două în care
avem genotipuri versus rezultate.
Cele trei genotipuri sunt heterozigote
mare-mare, mic-mic
și mare-mic.
Dar haideți să o facem -- pur și simplu să fie
simplu în ceea ce privește alelele.
Dacă există un avantaj selectiv -
sau există o
asociere perceptibilă
între seropozitiv,
seronegativ și alelă,
ar trebui să îl puteți vedea
atât în ​​genotip, cât și doar în
alelă.
Alela este mai simplă.
Este o matrice două câte două.
Și deci acestea sunt datele,
doar aceste patru casete de aici.
Alela mare este 1.278 observate
negative și 1.368 observate
pozitive pentru un total de 2.646.
Puteți vedea că
există mai puține totaluri
în populația chestionată
a mutantului de ștergere.
Acest lucru este în concordanță cu
afirmația pe care am făcut-o tot timpul.
Este de aproximativ 9% în
populația umană generală
și este de 9% din această populație.  Asta e
bine.
Dar acum trebuie să
corectezi pentru asta.
Trebuie să...
nu poți să întrebi,
este mai frecvent aici sau nu?
Trebuie să corectați pentru
frecvențele reale
din populație.
Și modul în care se face este să
calculezi un alt tabel, care
este numărul așteptat al fiecăreia dintre
aceste combinații de mare
cu seronegativ,
mare cu seropozitiv
și așa mai departe, în
ipoteza
că este complet aleatoriu.
Știți
frecvențele alelelor din populație,
dar spuneți că acestea sunt
asociate aleatoriu dacă este
seropozitivă sau seronegativă.
Folosiți aceste totaluri
aici și frecvențele
din populație pentru a
genera acest final așteptat
al ipotezei aleatorii.
Și apoi cauți
abaterea celor reale
dintre cele observate
față de cele așteptate.
Deci, orice abatere între
așteptat și observat
va fi
semnificativă în acest sens.
Deci, vrei să faci este să iei
diferența dintre cele observate
și cele așteptate.
Deci lucrăm la
o statistică aici,
un tip de măsură
care va determina
cât de departe de așteptări
sunt observațiile
din partea stângă
în acest doi câte doi?
Și astfel, pentru fiecare pătrat
din două câte doi,
găsiți un
număr așteptat corespunzător
și îl scădeți.
Acesta este punctul de plecare.
Dar nu-ți pasă dacă
este negativ sau pozitiv.
Vrei să-l faci pozitiv.
Deci trucul pe care îl vom folosi adesea
este să luăm pătratul.
Deci ai putea lua
valoarea absolută.
Luați pătratul pentru
chi-pătrat, destul de ciudat.
Și apoi vrei să-l pui
pe un fel de scară standard,
astfel încât atunci când faci un chi-pătrat
pentru orice fel de fenomen, să
poți compara.
Și modul în care faceți asta este să
împărțiți la numărul așteptat.
Sau după cum arată asta, dacă
aceste cifre ar fi cu adevărat uriașe,
acest lucru le-ar reduce.
Foarte mic, va
aduce același punct.
Deci, luați suma peste
toate pătratele de aici,
și asta înseamnă 15,6.
Și asta înseamnă că se
abate de la așteptare
cu această sumă normalizată ca
o fracțiune din așteptată.
Acum, pentru a determina doar o mică
lumină laterală pe chi-pătrat,
pentru a determina
probabilitatea ca 15,6 să
fie semnificativ,
ce
înseamnă asta, uitându-ne la 15,6?
Doriți să transformați acest lucru
într-o probabilitate,
deoarece probabilitățile sunt
limbajul comun în care ne putem
împărtăși cu toții surpriza că acest lucru
este diferit de așteptat,
ipoteza nulă că
aceasta este aceeași cu cea așteptată.
Și așa că pentru a
evalua asta,
trebuie să întrebi câtă
libertate există -
grade de libertate.
Acesta este jargon pentru, în
câte moduri diferite
pot varia aceste două numere?  Ei
bine, din moment ce știm
numărul total,
când observăm numărul de
CCR5, acesta fixează în coloane
numărul de ștergeri, nu?
Pentru că va fi doar
numărul de alele mari luate
din total.
Deci, într-un fel, gradele
de libertate sunt doar unul.
Ai reparat acest număr, iar
celălalt este acum cunoscut.
Și același lucru este valabil și
pentru rânduri și coloane.
Deci rândurile minus--
sunt doar unul, iar
coloanele sunt una.
Și astfel toate
gradele de libertate
sunt produsul care rânduri
și coloane, care este unul.
Așa că conectați asta.
Dacă vă uitați în
statistica dvs. standard...
sau în cartea dvs. de statistică
sau pachetul de software preferat, Excel
sau orice altceva, introduceți
această valoare chi-pătrat
și aceste grade de libertate
și obțineți această probabilitate,
care este  foarte semnificative.
În general, mai bine de 5%
înseamnă că vei
greși doar 20% din timp.
Unii oameni ar prefera să...
asta înseamnă că vei greși de opt
ori în 10.000 sau ceva de genul
ăsta.
Foarte, foarte rar.
BINE.
Acum asta e grozav.
Aceasta este o matrice două câte două.  Am
găsit o asociație.
Avem un
mecanism molecular plauzibil
în diapozitivul precedent.
Dar cum am
scos CCR5
din... acest iepure din pălărie?
Adică, de ce CCR5?
Există 40.000 de
gene în genomul uman.
Da?
PUBLIC: Ce este?
Eram curios,
ce populație este?
Adică, în care există
ceva mai mulți
oameni seropozitivi sau seronegativi.
Acesta trebuie să fie un anume...
GEORGE CHURCH: Oh, da.
Acesta este un
studiu de caz și control în care
încercați să obțineți un
număr aproximativ egal de aspecte negative
și pozitive care sunt potrivite
pentru grupul socioeconomic
și rasă și gen
și lucruri de genul acesta.
Deci asta este o configurație.
Dar atunci... dacă nu există
un raport de risc uriaș pentru cele două
alele, atunci te vei aștepta
să fie aproape de
frecvența populației, ceea ce înseamnă
că nu poți să
te uiți la inspecție
și să spui, oh, da.  .
Toate seropozitivele
sunt alela mare.
Nu am avea nevoie de un
chi pătrat în acel moment.
Dar aceasta este destul de aproape de
frecvența populației
și de aceea a trebuit să
facem un chi-pătrat.
BINE.
Dar întrebarea pe
care o punem acum
este cum am ales CCR5?
Și am introdus acest lucru ca
fiind un receptor presupus
pentru virus, dar una dintre
primele dovezi
că acesta a fost un
receptor presupus pentru virus
a fost acest studiu de asociere.
Deci, cum a lovit
receptorul de chemokine?  Ei
bine, ai putea spune, ei bine,
pentru că un fel de bănuială
că chemokinele sunt
implicate în imunologie
și imunologia este
importantă în lupta împotriva virușilor,
dar asta nu ar sugera
că este un receptor real.
Cred că acestea sunt...
există tot felul de
presupuneri inspirate.  În

spatele scenei se întâmplă biochimie și așa mai departe.
Dar să lăsăm asta
deoparte pentru moment
și să luăm
cazul mai general în care ați
vrut să testați nu doar
această ipoteză,
că CCR5 este implicat,
ci ați
testat apoi implicit sau în mod explicit
fiecare genă.  Ai
trecut prin
fiecare genă și ai
luat fie cele mai
comune alele, fie ți-ai
secvențiat propriul
genom și ai
găsit alelele pe care le ai,
fie că sunt comune sau rare.
Nu-ți pasă.
Și vrei să întrebi,
care este asociația?  Să luăm în
considerare
panoul din dreapta sus aici
unde avem un anumit raport de risc,
unul destul de subtil, 1,5.
Amintiți-vă, vorbeam
despre rate de risc de 75
în cazul autismului.
Acesta este doar 1,5.
Raportul de risc foarte subtil, așa cum
cred că în ultimul
ar fi putut fi un
raport de risc subtil.
Și axa x va
fi numărul de alele
pe care le
testați ipotetic.
Acest lucru ar putea fi legat
de numărul de gene pe
care le testați
sau ar putea fi
mai mult decât numărul de
gene pe care le testați,
deoarece puteți avea mai mult
de o alele pe genă
pe care ați dori să o testați.
Este această alelă a acestei gene
importantă în această boală
sau aceasta este cealaltă?
De exemplu,
celulele falciforme sunt importante,
dar diverse alte
mutații ale hemoglobinei nu sunt.
Această ștergere a chemokinei este
importantă și poate alta
nu este.
Multe mutații ale chemokinelor
vor fi neutre.
BINE.
Deci, pe măsură ce creșteți numărul
de gene și alele de la--
aici este de 10 la a patra în sus--
apoi numărul de perechi frați--
deci aceasta este o simulare care acoperă
tot felul de experimente
pe care le-ați putea face
în care puteți utiliza

metode de calcul  pentru a ajuta la ghidarea
proiectării experimentelor.
Dacă ai făcut un
experiment costisitor
și s-a întâmplat să
folosești prea puțini pacienți și prea
multe alele, atunci este posibil să fi
folosit greșit resursele.  Ar fi trebuit să
faci
mai puține alele și mai mulți pacienți
sau așa ceva.
Și aceasta oferă
câteva îndrumări aici.
Dar puteți vedea
că pentru a ajunge
la un număr foarte mare
de alele,
aveți nevoie de o
creștere destul de modestă
a numărului de pacienți.
Și asta se datorează
termenului exponențial pe
care îl aveți în aceste
distribuții de probabilitate.
Deci, de fapt...
dar cu toate acestea,
este o mare problemă din punct de vedere al costurilor
să crească de la, să zicem,
400 de pacienți la 1.600.
Cu toate acestea, este
doar liniar la pacienți, în
timp ce este exponențial în ceea ce privește
numărul de alele pe care le puteți testa,
așa că aceasta este vestea bună.
Și puteți vedea că unele
dintre aceste alte panouri
arată efectul
variației altor parametri.
De exemplu, aici, în
stânga,
puteți varia
frecvența populației alelei.  Pe măsură ce
ajungeți la alele foarte,
foarte rare
din partea dreaptă a
axei orizontale aici, atunci
numărul de perechi de frați--
frați-sori,
frați-frați
de care aveți nevoie-- începe
să treacă prin acoperiș.
Și acum este exponențial
pe ambele axe,
adică
este o relație directă.
Întrebare?
PUBLIC: Care este acea
valoare z acolo?
GEORGE CHURCH: Hmm?
PUBLIC: Care este acea
valoare z de acolo?
GEORGE CHURCH: Oh, aceasta este
frecvența populației cu care
sunteți...
PUBLIC: În partea de jos?
GEORGE CHURCH: Hmm?  Ei
bine, pe... pe cel despre care tocmai
vorbeam din stânga,
frecvența populației
este axa orizontală
și variază de la aproape unitate
la 10 la minus nouă.
Este o
frecvență de alele foarte rară.
În dreapta, cel
cu care am început, în dreapta sus,
tocmai am ales 0,5,
care ar fi foarte... să
fie aici, în
capătul din stânga cadranului din stânga.  Așa că
alegeți una dintre aceste
frecvențe alelelor, destul de...
unde
frecvența celor două
alele din
populație este egală cu cea în care
faceți restul simulării.
Vă puteți gândi că
toate aceste panouri
ar putea fi un
afișaj multidimensional,
dar am vrut să
le scot unul câte unul.
Și, de fapt, le-am făcut
toate acestea în Excel
folosind ecuațiile care sunt
prezente în această referință
care este dată în slide-urile de aici.
Un semn bun al unei
lucrări bine scrise
este ca un fel de
individ obișnuit să
o poată reproduce.
Deci avem câte...
așa că am vorbit
despre noi polimorfisme.
De fapt, întrebarea care a
apărut în timpul pauzei
a fost dacă selecția și derivea
determină ca frecvențele alelelor să se fixeze
destul de rapid, deriva
în populații mici, populațiile de
mărime normală
vor deriva
în timpi de evoluție destul de scurti
și selecția
dacă aveți un coeficient de selecție ridicat.
de fixare a costurilor.  De
ce avem deloc
frecvențe alelelor?
De ce nu este totul fixat la
100% pentru o anumită alelă?
Și răspunsul este mutația.
Și de unde provin toate aceste noi
mutații sau polimorfisme...
de fapt,
acestea ar trebui probabil
numite mutații,
deoarece majoritatea
au frecvențe mai mici de 1%.  Ei
bine, iată un model specific
care nu urmează toate
ipotezele pe care le-am avut înainte,
dar vom folosi un alt --
vom folosi un calcul din spatele plicului
pentru a vă oferi
o idee despre ceea ce
este adevărat pentru
ceea ce este probabil să fie cazul
populației umane.
Deci, populația umană,
există un pic
de necunoscut în unii
dintre acești parametri,
așa că ar trebui să le luați pe toți
cu un grăunte de sare.  De fapt,
tot ce spun ar
trebui să iei.
Dar numărul de
populații pe care le-am
avut de la un blocaj
în populația umană -
poate au fost chiar și de la
10 până la al patrulea oameni
la un moment dat sau altul.
Poate mai putin.
Dar de atunci, au
existat aproximativ 5.000 de generații.
Și în acest
timp, populația noastră
a crescut la
șase miliarde de oameni.
Acesta este n prim nn.
Și rata de mutație, așa cum am
menționat mai devreme ca răspuns
la o întrebare, este de
aproximativ 10 până la minus a
opta per pereche de baze per
genom per generație.
Și astfel dimensiunea genomului
este de aproximativ șase miliarde.
Întâmplător, la fel
ca și dimensiunea populației.
Coincidență totală.
Apoi, de la 10 la minus de opt
ori acel număr de perechi de baze
înseamnă că aveți
aproximativ 60 de mutații care
apar într-o generație.
Deci ai un
flux constant de noi mutații.
Acum, dacă luați
asta... aproximativ
vorbind, dacă luați asta
peste 5.000 de generații,
aveți de 60 de ori 5.000.
Aveți un număr foarte mare...
de ordinul a 10 până la a
patra mutații
care s-au acumulat
în populația noastră.
Presupunând o
deriva relativ mică din cauza
acestei populații în creștere exponențială
și a unei
selecții relativ reduse, atunci
acesta este numărul
care s-ar fi putut acumula.
Puteți face corecții subtile
pentru această creștere exponențială.
Numărul de mutații pe care le-ați
avut la început
va avea o frecvență mai mare,
dar vor fi mai puține,
deoarece populația era mai mică.
Dar, oricum,
înțelegeți imaginea, este
că
numărul total de mutații
în oricare dintre acestea care
sunt noi de la acea nouă-- de
acum 5.000 de generații
va fi de ordinul 10
până la a patra în corpul vostru, nu
toate.  fac bine pentru tine.
Și pentru fiecare dintre aceste
mutații rare --
ar putea avea o frecvență de la
aproximativ 10 până la minus cinci --
vor fi aproximativ 10 până la al
patrulea oameni de pe Pământ
care vor împărtăși acea
mutație foarte rară cu tine.
10 la minus 5
sună foarte rar,
dar când îl înmulți
cu șase miliarde de oameni,
sunt mulți oameni
care îți împărtășesc asta.
Este o nouă mutație.
BINE.
Deci, acasa este...
și aceasta este de la
această referință de aici.  Mutații dăunătoare
genomice mari se

acumulează peste aceste 4.000 -
un număr mare
de generații.
Și ar confunda
metodele de legare
și ar
confunda ipotezele
care spun că
alelele comune -
alelele comune sunt cauzale.
BINE.
Deci, să presupunem că am făcut
un studiu de asociere.
Fie am făcut-o
pe o genă, am ales
una din pălărie
precum CCR5, fie am
făcut-o pe un studiu complet al genomului
, 40.000 de gene,
toate alelele pe care le cunoaștem.
Pentru a face acest lucru din urmă,
a trebuit să avem o populație mare de pacienți
.
Dar să presupunem că am făcut asta.
Acum vrem să demonstrăm că
acea asociere este...
acea statistică grozavă pe
care am obținut-o,
dacă avem o
populație suficient de mare de pacienți,
este încă doar o statistică.
Ceea ce va constitui dovada este că,
după ce găsim asocierea,
facem o copie a acelei
mutații, izolată
de celelalte trei milioane de
polimorfisme care
plutesc
în corpul tău
și facem un fel de test.
În mod ideal, am
face o pereche izogenă
de oameni care diferă doar
prin această mutație.
Acest lucru nu este în general considerat
fezabil din punct de vedere medical sau etic.
Dar într-un fel sau altul, o
poți face pe celule umane
sau o poți face într-un
sistem model de mamifer.
Dar trebuie să faci
ceva care este
aproape de izogenic, o
copie a acestei mutații
și să arăți că are un
fenotip care are sens.
Și apoi, doar pentru a vă
asigura că nu ați introdus
alte mutații,
oamenii de știință cu adevărat atenți
vor inversa acel
polimorfism și vor arăta acum că
nu mai aveți
acel fenotip.
BINE.
Deci haideți să trecem
printr-un exemplu.
Iată al treilea
exemplu din această prelegere
al unei alele foarte specifice în care am

arătat
baza moleculară a acesteia și este
al doilea exemplu
în care nu se codifică
și este al doilea exemplu
în care se va repeta.
Deci asta este doar pentru...
Nu vă dau o
mostră aleatorie aici.
Am orientat în mod special acest lucru
către gene foarte interesante,
trăsături foarte interesante
care sunt asociate
cu
alele repetitive necodificatoare.
În acest caz, trăsătura
care a atras atenția
acestor cercetători--
nu este neapărat dovedit
că aceasta este relația.
Dar asocierea
care a fost studiată
a fost între trăsăturile legate de anxietate
, anxietate
și un polimorfism în
transportorul serotoninei.
Aceasta este o lucrare științifică.
Acum, următorul pas
este să...
OK, a fost găsit asociat.  Au
fost o mulțime de alte alele
mutate aleatoriu,
pentru că aceștia sunt oameni.
Nu avem control asupra cine se
împerechează cu cine, sau foarte puțin.
Deci primești ceea ce ți se oferă.
Puteți face sondajul
cât de bine puteți.
Dar acum pentru a o muta
către o bază mecanică
și o dovadă a introducerii
doar a acestei mutații punctuale.
Acum care este mutația
găsită în acest caz de
relație de anxietate în acest
transportor de serotonină?
Este în amonte de primul
ARN care codifică un axon.
Este o deleție de 44 de perechi de baze
într-o regiune repetitivă,
într-o regiune care ar putea fi
responsabilă pentru promovarea
transcripției.
Ai alelele scurte și lungi
, la fel ca în CCR5.
În acest caz, este într-un
element promotor presupus.
Și când realizați acest
construct și îl conectați
la o activitate enzimatică a luciferazei
in vitro,
în celule de cultură, astfel încât să
nu trebuie de fapt să
construiți
un om mutant,
puteți vedea acum că
alela lungă
produce întotdeauna niveluri mai ridicate
de expresie
decât  alela scurta.
Și aceste mici bare de eroare
de deasupra fiecărei măsuri
arată măsura dvs. statistică
a abaterii standard,
așa cum am făcut în prima prelegere.
Și dacă media neagră, care
este înălțimea barei,
este diferită de
media albă cu mai mult de câteva
dintre aceste abateri standard,
care este rădăcina medie pătrată
a
abaterilor standard ale fiecăreia
dintre măsuri, atunci
o numiți  semnificativ din punct de vedere statistic.
Și asta
înseamnă aceste stele triple.
Este
prescurtarea statistică pentru aceasta
este semnificativă statistic
la limita pe care o folosim.
Să zicem, 5%.
Acum, în acest caz, este un
fel de arătare
pentru că fiecare dintre
ele este
semnificativ statistic prin două teste diferite...
complet diferite
aici.
Dar ideea este că
acest lucru nu dovedește
că anxietatea este asociată în mod semnificativ
cu asta.
Dar demonstrează că acest
polimorfism repetitiv
este capabil cauzal de niveluri de
transcripție diferențiate
pentru o genă reporter.
Deci, introducându-l într-
un sistem celular curat,
puteți testa cel puțin o
parte din mecanismul care
ar putea fi implicat în
asocierea care v-
a atras inițial atenția.
Acum, după cum puteți
vedea, intrăm
într-o fază destul de matură și destul de
nouă a geneticii umane.
Unele dintre conceptele
care sunt folosite aici
vor fi utile într-o
varietate de alte sisteme
în care avem relativ puțin
control asupra geneticii.
Dar, cu siguranță, la oameni,
există o nevoie foarte mare.
Și acolo unde s-
a întâmplat istoric
este cu legătura mendeliană,
care ar implica
familii foarte mari cu
un pedigree complet,
multi-generații,
străbunici și mame,
până în jos, sute
de oameni într-o familie.
Și asta e problema, pentru că
nu sunt atât de multe boli
pentru care ai
familii numeroase
cu moștenire mendeliană simplă
.
Bolile comune tind să
fie mult mai complicate,
implicând mai multe
gene simultan
și familii mici.
Apoi, există
dezechilibru de legătură,
care depinde de
aceste alele comune în
care populația a
trecut printr-un
blocaj deosebit de mic și unde
alela comună este la
o distanță destul de bună
de cea cauzală.
Dar vă permite să-l
mapați într-un stagiu,
apoi vă agățați și
faceți testarea mai costisitoare
a ipotezelor pentru toate și
secvențierea și căutarea

alelelor potențial cauzale.
Odată ce găsiți o
alelă potențial cauzală, ceva
care pare suspect,
poate ceva
care se află într-o regiune de codificare
care este conservată,
aceasta este prima prioritate,
în ciuda tuturor contraexemplelor pe care le-am
dat.
Și apoi mergi înainte.
Dar problema este că
ești la cheremul
recombinării
care ar fi putut avea loc
în acea populație, dar ajungi
la populații foarte interesante,
cum ar fi oamenii de
origine afro-americană,
unde populația
este foarte bătrână, nu a
trecut printr-un
blocaj al populației.  .  Dezechilibrul
util al legăturii

este mai degrabă pe câteva kilobaze
decât pe sute
de kilobaze, deci
este greu să găsești
lucruri care sunt legate.
Adică insistă,
dar nu cauzative.
Insista asupra alelei cauzale.
În schimb, trebuie să căutați
direct alelele cauzale.
Și aici... acum cauți
alele cauzale comune.
Aceasta are problema despre care am
vorbit, și anume
că poate
alelele comune nu sunt adesea cauzatoare.  Au
fost selectați.
Deci, atunci intri în
scenariu, ce se întâmplă dacă am
vrea să ne uităm la toate alelele?
Ei bine, teoretic, nu e
nimic rău în asta.  Ar fi
grozav.
Am putea face
studiile de asociere.
Ar trebui să avem
populații destul de mari.
Dar ați văzut că a fost liniar
cu o creștere exponențială a
numărului de ipoteze și
ați putea clasa acele ipoteze
după probabilitate a priori și
așa mai departe, dar este scump.
Deci, discuția
trebuie să includă acum
o mică discuție
despre noile tehnologii care
ar putea face acest lucru mai puțin costisitor
și o discuție despre cum am obținut
primul genom și despre modul în care
noile tehnologii ar putea
fi puțin diferite.
Dar vom face acest lucru
în contextul calculului,
în sensul cum ne
ocupăm de erorile aleatoare și sistematice
?  Pe măsură ce ne
planificăm
strategia de obținere a
fiecărui genom,
secvență personală a genomului pentru aproximativ 1.000 USD
, cum alegem
ce tehnologie să urmăm?
Care dintre ele au
cele mai mici erori intrinseci, aleatorii
și sistematice?
Așa că trebuia să studiem
primul genom
pentru a vedea ce am înțelege prin
erori aleatorii și sistematice?
Câți oameni de aici știu
deja care este diferența?
Câțiva.
BINE.
Dar oricum, fie că faci sau
nu, e bine ca sufletul
să treacă prin câteva
exemple reale în acest sens.
O mutație aleatorie
este ceva care
apare de fiecare dată când
faceți experimentul.
Primești o altă eroare.
Iar una sistematică
este ceva în care,
dacă o faci din nou
și din nou în același mod,
vei obține aceeași
eroare sau o simplă clasă
de erori care apar de mai multe ori
, iar și iar.
Deci, pentru secvențiere, procesul
implică alegerea a ceva pe
care doriți să-l
secvențați -- o vom
numi o clonă sau un șablon.
Apoi realizează
secvențierea
și apoi asamblam
aceasta într-o
secvență interpretată semnificativă.
Și acesta este un
exemplu în care am fi
ales aceste clone mari.
Cu alte cuvinte, ați putea
fragmenta aleatoriu genomul
în clone mari de
100 de kilobaze numite cromozomi
artificiali bacterieni
, de exemplu.
Și apoi totul este
aleatoriu, și deci există
o pușcă de acea scară.
Și apoi îl împărțim
aleatoriu în bucăți mai mici,
care ne oferă
mici secvențe.
Și apoi, în computer, le
asamblam prin metode pe
care le vom discuta în
prelegerea următoare, care
pot lua chiar și
secvențe destul de diferite decât a le asambla.
În acest caz, vorbim
de secvențe foarte asemănătoare.
Și apoi asamblați
secvențele mici în secvențe mari
și asamblați
secvențele mari
în secvențe și mai mari și
apoi aveți totul.
Dar puteți vedea că există o mulțime
de șanse de eroare aici.  Îl
facem să pară
simplu în acest slide,
dar vom vorbi despre
erori aleatoare și sistematice
într-un moment.  De
unde am luat
acele secvențe,
acele mici secvențe pe
care vrem să le asamblam?
Vom trece prin
câteva metode într-un moment,
dar cea mai comună
de departe cred
că generează peste
90% din secvența genomului uman
în
ultimii doi ani
este electroforeza capilară
a
produselor terminate cu polimerază marcate fluorescent.
Când efectuați electroforeză
,
separați fragmente de ADN,
care au n nucleotide,
de un fragment de ADN care are
n plus o nucleotide.
Aceasta este o diferență foarte subtilă
pe măsură ce n devine mare.
Pe măsură ce n devine mare,
devine din ce în ce mai greu
să separați n de n plus unu.  Pe
măsură ce face acest lucru, începi să
primești tot felul de erori.
Numărul total de erori aici,
în colțul din stânga jos,
este numărul de inserări
plus numărul de ștergeri
plus numărul de
înlocuiri plus n, care
este o abreviere pentru no call.
Înseamnă că software-ul a simțit
că este atât de aproape încât
nu l-a putut suna deloc.  S-a
spus doar că este n.
Nu știu dacă
este un A, C--
nu știe dacă este un A,
C, G sau T. Îl numește nu.
Și, așadar, dacă te uiți
prin acest tabel,
arată că pe axa verticală
pentru fiecare dintre aceste șase
diagrame cu bare, pe măsură ce mergi în sus pe
axa verticală,
treci de la
citiri foarte scurte, unde
este ușor să separați n de
n plus unu electroforetic
la  cele foarte lungi în care
începi să acumulezi erori de
ștergere a inserțiilor
, substituție de ștergere a inserțiilor
și n.
Toate cresc cu lungimea.
Și deci te poți gândi la asta
ca la o eroare aleatorie suprapusă erorii
sistematice: dacă
faci întotdeauna experimentele,
aceeași pereche de baze este întotdeauna
la sfârșitul alergării, va
avea întotdeauna
o rată de eroare aleatoare mai mare.
Deci aceasta este o combinație
de erori aleatoare și sistematice.
Deci haideți să trecem prin
câteva exemple aici.
Tocmai am
izolat șablonul
pentru a-l pregăti pentru secvențiere,
există erori sistematice.
Dacă aveți anumite
tipuri de repetări,
repetări lungi, inversate sau
anumite tipuri de
elemente de restricție pe care bacteriilor
nu le place sau le place
să le mestece, atunci
nu veți primi clona.
Și asta ar afecta prima
parte a Proiectului Genome,
dacă ai continua să încerci din nou
și din nou în același mod,
și pur și simplu nu ai
obține anumite clone.
Parcă ar fi
fost o gaură acolo.
Știi că există
ceva acolo,
dar nu l-ai putea clona.
Secvențiere-- agrafele de păr se pot
forma în singura catenă
de acizi nucleici
în care încercați
să separați n de n plus unu.
Și acele agrafe de păr scot apoi
electroforeza cu gel
și o fac să pară mult
mai mică decât este de fapt.
Repetările tandem provoacă
o problemă în toate
aceste trei etape ale secvențierii.
Primești niște
bâlbâială de polimerază
și primești mici artefacte.
În repetările de asamblare,
asamblați
prin alinierea secvenței.
Dacă aveți o
repetare, repetarea se
va alinia la fel de
bine, deoarece este
o repetare în
genom ca o repetare din
cauza repetății experimentale
și, prin urmare, alinierea
poate fi oprită.
Erorile pe care le-ați primit
de la acești pași anteriori
fac dificilă asamblarea.
Polimorfismele arată ca erori.
Clonele himerice înseamnă că
ai lucruri
care au fost asamblate
greșit aici și așa mai departe.
BINE.
Când facem această
selecție aleatorie a clonelor mari
și selecția aleatorie a
clonelor mici pentru secvențiere,
vrem să știm când să renunțăm.
Acum ați putea spune, ei
bine, vom
renunța odată ce le-am
asamblat pe toate,
dar trebuie să acumulați
o anumită cantitate de date
în avans înainte de a
încerca să o asamblați.
Și astfel există
diverse calcule
cu privire la momentul în care să renunțe.
Și aceasta este legată de
distribuția Poisson,
dar nu este exact.
Și, de fapt, unul dintre
studiile făcute în 1988 a
făcut câteva
ipoteze slabe despre --
amintiți-vă, am menționat
în prima prelegere
ipotezele
distribuției Poisson
care o fac o
aproximare -- când
devine o aproximare
la o distribuție mai formală
precum  binomul.
Oricum, această aproximare ar
trebui să obțineți, pe măsură ce
obțineți o
acoperire din ce în ce mai mare,
adică din ce în ce mai multe
repetări experimentale,
veți umple în cele din urmă
toate golurile.
Și asta înseamnă că vei obține o
acoperire completă 100%
și ar trebui să se
apropie asimptotic de asta.  Ei
bine, dacă folosești
incorect Poisson,
așa cum au făcut autorii în 1988,
practic mergi la infinit.
Obțineți o acoperire de 200%, ceea ce
este imposibil din punct de vedere fizic.
Dar atât un
studiu anterior, pe care ei l-au ignorat,
cât și un studiu mai recent
au dat dreptate.
Și acestea sunt
măsuri ușor diferite,
dar ambele converg către 100%.
Și vă îndemn să vă
uitați la asta dacă
proiectați un experiment
cu o formulă simplă.
Pe de altă parte, dacă doriți
să proiectați experimentul mai
explicit, ajungeți în cele din urmă
într-un punct
în care o formulă analitică simplă
nu funcționează
și trebuie să faceți Monte Carlo.
Am tratat acest lucru
în prima clasă
de ecuații diferențiabile analitice versus numerice

și apoi în multe alte cazuri.
Simularea pe care
vrei să o faci este dincolo...
este prea greu de făcut analitic.
Așa că Gene Myers a înființat - doar a
enumerat toate lucrurile pe care el
credea că ar fi --
ar putea afecta capacitatea de a
asambla o secvență a genomului.
Lungimea de citire și tipurile de
repetări și toate aceste lucruri
au fost simulate.
Și a declanșat simularea pe
proiecte cu dimensiunea genomului uman real
și a ajuns la concluzia
că ai putea face un
asamblare de pușcă a genomului unui mamifer.  S-a format o
companie numită
Celera.
Gene Myers a fost angajat
ca guru al computerelor.  Au
adunat un grajd
mare de computere
și au început să facă asta pe
genomul uman și al șoarecelui.
În
cele din urmă, genomul uman nu a fost realizat prin această metodă,
dar genomul șoarecelui a fost și
a fost un ansamblu destul de bun.
Deci, genomul Drosophila care
lipsește repetele Drosophila
a fost, de asemenea, realizat prin această metodă.
Deci, aceasta este scalată
foarte grațios
de la prima secvență de pușcă,
care a fost pe o plasmidă de patru kV,
până la genomi de dimensiunea mamiferelor.
Niciun genom de mamifer nu este
complet secvențial,
așa că nu putem
declara victoria cu adevărat.
Dar genul de simulare pe care
a făcut-o aici s-
a desfășurat foarte bine.
Chiar aici, în Boston,
va exista...
când vom începe să ne
gândim la viitorul

tehnologiei de secvențiere, ne-am
dori cu toții... acest lucru este aproape
necontroversat cu privire
la cât de mult ne dorim ca
genomul să nu coste 3 miliarde de dolari,
dar costă 1.000 de dolari.
Și acum există
o serie de oameni
care fac pași foarte hotărâți
pentru a ne duce la acel punct.
Pentru a înțelege
erorile sistematice și aleatorii care
pot apărea în acești
pași, să luăm
această electroforeză cu gel dideoxi
despre care am vorbit aici.
Aveți patru
terminatoare de culori diferite.
Aici polimeraza
nu poate merge mai departe,
deoarece aici există un
grup de blocare,
care este marcat fluorescent.
Și dacă șablonul
din extrema stângă
aici este gata să accepte
un A, veți obține un A.
Și acest n și n minus
unul se vor separa
pe această electroforeză și
cele patru culori vă vor oferi
acest model în patru culori
în care intensitatea  reflectă o
terminare bună
la acea poziție
și, practic, puteți
continua să o citiți.
G, C, G, G, A, T.
Acum, aceasta este în
partea bine comportată.
Un exemplu de eroare sistematică pe
care o obțineți în această extensie
apare aici, în
colțul din dreapta sus al diapozitivului 40.
Acum aveți... din cauza
unuia dintre aceste agrafe
pe care le-am menționat
mai înainte, aveți
o grămadă...  din șapte nucleotide,
toate în aceeași poziție.
O
metodă complet alternativă care
nu implică
electroforeza pe gel
se numește
secvențiere pirA, iar acesta
este un echivalent care poate fi
realizat cu adăugare fluorescentă.
În loc să
le separi în timp după
mărimea lor în
electroforeză,
în timp întrebi în serie,
vrei un A aici?
Dacă da, atunci
ai un pic verde-- ai
o mică
privire de reprezentare a
eliberării de pirofosfat
sau încorporarea
de fluorescent A.
Și apoi întrebi,
vrei un T
și așa mai departe, și mergi de-a lungul.
Și fiecare semnal înseamnă
da la răspunsul
că este gata pentru
acea bază anume.
Și puteți vedea că acest lucru
nu are probleme
cu această regiune de ac de păr.
Deci, atunci când aveți o
eroare sistematică,
trebuie să schimbați
metoda pe care o
utilizați destul de radical.
Componenta opusă sau o
metodă complet diferită.
Dacă ai... la început,
am avut diferențe uriașe de
intensitate a
fluoroforilor și noi enzime
și noi fluorofori au fost
dezvoltate de Tabor și Matthews
și Glaser și așa mai departe.
Și acesta a fost un progres uriaș
în uniformizarea totul
și eliminarea
erorilor sistematice.
Deci genul de lucruri care se află
la orizont și care sperăm că
vor fi discutate
mâine la Boston,
am vorbit despre acest
număr scurt de extensii de bază,
cum ar fi
secvențierea puterii, extensiile mai lungi
în
matricele capilare, care, matricele capilare
se schimbă de la
low-  termină capilarele
în așchii microfabricate.
Voi arăta un exemplu de
specificație de masă într-un moment.
Secvențierea prin
hibridizare pe matrice
va ilustra ca un preludiu,
ca exemplu de
tehnologie Affymetrix în acest slide.
BINE.
Deci ideea de aici, aceasta este
în principal pentru re-secvențiere.
Unele dintre modalitățile de reducere a
costurilor de secvențiere a
genomului uman nu se vor
aplica pentru secvențierea
genomilor noi.
Dar totuși, trebuie
să le urmărim,
pentru că acesta poate fi modul în care
obținem genomul uman de 1.000 de dolari,
chiar dacă nu obținem alții.
Și aici, știți
secvența, cu excepția faptului
că există posibilitatea ca
la orice bază să existe un polimorfism.
Ar putea fi orice
substituție de bază la orice bază.
Și deci nu
știi neapărat dinainte care

sunt cele comune sau rare,
dar știi
succesiunea canonică.
Și astfel, în fiecare poziție, vei
face o oligonucleotidă de 25 de meri
care se va lega la o versiune
marcată fluorescent
a genomului tău
sau la o bucată din genom.
Și acesta este de fapt dezvoltat
pentru re-secvențierea HIV
de către Affymetrix.
Și în această
poziție de mijloc, veți
introduce toate cele patru
substituții posibile, T, G, C sau A.
Și veți lua în considerare
fiecare șablon posibil.
Deci, dacă aveți
șablonul, care este... să
presupunem că acestea sunt cele
două alele care
apar într-o populație umană
sau în eșantionul dumneavoastră.
Poți avea această secvență și
apoi toate variațiile pe ea,
mergând de-a lungul, schimbând T,
G, C, A pentru prima bază,
a doua bază, a
treia bază și așa mai departe,
până când o atingi pe aceasta.
Și aici
apare polimorfismul real.
Și puteți avea fie
acesta ca context,
fie acesta ca context.
Și aceasta este schematică Și
acestea sunt datele reale.
Acestea sunt date reale
aici, unde
aveți contextul
alelei A sau contextul
alelei C.
Puteți avea homozigoți
sau heterozigoți.
Și în homozigotul A,
puteți vedea că luminează
cel mai bine, cea mai bună
hibridizare când aveți
A în poziția de mijloc.
Poziția de mijloc
este cea mai sensibilă
la schimbările de hibridizare.
Și pentru C,
îl aveți în rândul C aici.
Și nu uitați,
schimbați toate bazele
în fiecare poziție.
Unu doi trei patru.
Acesta este cel în care
baza de mijloc a poziției de mijloc
este în contextul potrivit.
Deci, acesta este în
contextul A și în contextul C.
Și la heterozigot,
obțineți atât A cât și C.
Și așa s-a
făcut cu HIV.  S-a
făcut pe
BRCA1, pe mitocondrii.
Și acum
l-au aplicat cu napolitane întregi
întregului genom uman.
Și asta probabil costă de
ordinul a aproximativ 3 milioane de dolari.
Spectrometria de masă este o
altă modalitate care este
folosită, probabil nu pentru
secvențierea întregului genom,
dar este folosită pentru
polimorfisme cu un singur nucleotide.
Aceasta costă de ordinul
a 0,50 USD per polimorfism.
Dacă există trei milioane
de ei în genomul tău,
înseamnă o mulțime de 0,50 USD.
[Râsete]
Și iată cum arată
când îl citești.
Este într-adevăr la fel ca
electroforeza.
Acum puteți separa
o adăugare a unui A
de o adăugare a unui G. Și
diferența de masă dintre un A
și un G, aceasta este
chiar mai subtilă
decât diferența dintre
un n și un n plus unu.
Aceasta este doar o diferență
între un A și un C.
Este detectabil în asta.
De fapt, este
suficient de detectabil și cantitativ
încât să puteți pune în comun probe.
Aceasta este un pic o cascadorie,
dar este o cascadorie importantă
pentru a arăta că aceasta este într-adevăr
o metodă foarte precisă, deși
încă destul de costisitoare.
Acum, doar în încheiere,
vreau să vă dau
cel mai simplu
exemplu posibil despre cum
putem căuta prin secvențe.
Săptămâna viitoare, vă vom oferi
un mod mult mai riguros prin
care puteți căuta
prin secvențe
cu diferențe foarte mari
între secvențe.
Dar aici, tema
discuției de astăzi
este
diferențele subtile de polimorfism
care apar între tine și mine.
Și aici, unul diferit...
deci, în general,
cauți potriviri exacte.
Și o modalitate bună de a căuta
potriviri exacte este:
modalitățile bune sunt hashingul,
matricele de sufixe și arborii de sufixe,
în care, practic,
în fiecare dintre acestea,
căutați să utilizați
un cuvânt, fie un cuvânt
care este construit și stocat
de la sfârșit.  , sufixul, câte o
literă
sau este o bucată pe care o
puteți avea ca hash.
Și alcătuiești un tabel de căutare.
Și dimensiunea
acelui tabel de căutare --
este un compromis între
viteza de căutare
și dimensiunea tabelului.
Mărimea va fi... dacă
cuvântul are n nucleotide,
va fi patru până la n.  Va
fi
spațiul de stocare pe care trebuie să-l
puneți pe disc
sau pe RAM, RAM dacă
doriți să fie o căutare rapidă.
Și deci 16 este numărul magic,
într-un fel în stadiul
genomului uman,
pentru că patru până la al 16-lea
reprezintă patru miliarde de secvențe pe care le
poți reprezenta.
Dar este o masă uriașă.
Trebuie să aveți un tabel de
patru miliarde de ori cât de
mulți octeți aveți nevoie pentru a
stoca pozițiile.
De obicei, aproximativ patru
octeți de stocare.
Dacă reduceți
puțin acest lucru,
veți ajunge la
coliziuni în care
veți avea două lucruri care
au același hash sau sufix.
Dacă o faci...
și asta dacă o
faci mai mică.
Va ocupa mai puțin spațiu.
Dacă îl faci
mai mare, va fi nevoie de
o cantitate ridicolă de memorie RAM.
Și apoi iată un
fel de capricios -- un
alt exemplu de perlă
în care nu vrei doar să
găsești toate mutațiile de
aici la o densitate foarte mare --
o densitate ridicol de mare,
nu o bază anume
pentru fiecare câteva perechi de baze.
Nu doar vrei să le găsești,
dar vrei să le corectezi.
Și aici, perla
face înlocuirea.
Și după terapia genică,
toată lumea iese fericită.
BINE.
[RÂSETE]