Următorul conținut este furnizat de MIT OpenCourseWare sub o licență Creative Commons. Informații suplimentare despre licența noastră și despre MIT OpenCourseWare în general sunt disponibile la ocw.mit.edu. GEORGE CHURCH: OK. Bun venit la a doua proteină. La fel ca și în cazul analizelor ARN, am început cu, în acel caz, o scurtă discuție despre structura ARN, apoi am trecut la cuantificarea ARN. În acest caz, am petrecut puțin mai mult timp pe structura proteinelor și vom petrece puțin mai puțin timp pe cuantificarea proteinelor, care va fi subiectul principal astăzi. Dar parțial pentru că ARN-ul și cuantificarea proteinelor au multe teme în comun, așa că am acoperit unele dintre acestea. Și vom vorbi despre cum se poate integra cuantificarea proteinelor cu cuantificarea ARN și cu metabolismul. Deci data trecută am vorbit în principal despre structura și interacțiunea proteinelor cu molecule mici la nivel structural. Și de data aceasta ne vom îndrepta spre cuantificarea proteinelor și a interacțiunilor acestora cu alte proteine de molecule mici, astfel încât să putem aborda asta ca primul pas către analiza rețelei care va fi subiectul ultimelor trei prelegeri ale cursului. Așa că vom obține un indiciu despre asta la sfârșitul discuției de astăzi. Deci, la începutul cursului, am avut un diapozitiv care vorbea despre modul în care purificarea a fost o revoluție în multe domenii diferite -- unul dintre ele a dus la ADN recombinant și Proiectul Genom și așa mai departe. Astăzi vom vorbi mai mult despre purificare din punct de vedere din ceea ce ne spune despre proprietățile moleculei în sine, spre deosebire de purificarea de dragul ei. Cum putem să intrăm și să extragem date și să obținem valoarea maximă din purificare? Lucrurile pe care le așteptăm de la purificare sunt să reducem o anumită sursă de zgomot. Adică , în procesul de identificare sau cuantificare a proteinelor sau a componentelor acestora, dorim să îndepărtăm sursele -- sursa majoră de zgomot ar fi contaminarea mediului înconjurător sau, mai des, contaminarea cu alți membri de bună credință ai amestecului, alte proteine. care pot fi foarte abundente sau produse de defalcare sau produse conexe. Și vrem să-l separăm în suficiente componente diferite, astfel încât cele mai importante să fie închise în propriul lor mic coș și să nu interfereze prea mult. Deci, al doilea motiv pentru care am putea dori să purificăm este pregătirea materialelor pentru experimente in vitro. În timp ce studiem rețelele în următoarele trei clase, vom descoperi că adevărata problemă este că sunt suficient de complicate încât aveți nevoie de o modalitate de a izola o componentă de rețea de toate interacțiunile posibile. Și o modalitate de a face asta este să purificați acea componentă de rețea sau un număr de componente de rețea și să faceți o subrețea complet artificial in vitro. Deci, aceasta este o altă utilizare a purificării. Și, în sfârșit, și aceasta este tema principală pentru următoarele două diapozitive, este descoperirea proprietăților biochimice despre acea componentă în sine. Deci, ce puteți obține din procesul de purificare? Și acest lucru necesită o utilizare atentă a purificării. Acum, multe dintre aceste metode au fost dezvoltate pentru că funcționează bine, dar acum ne întoarcem și ne uităm la care dintre ele ne pot oferi informații despre biologia și chimia sistemului. Și astfel avem încărcătura unei molecule, despre care am vorbit data trecută ca fiind o interacțiune foarte importantă, relativ lungă, interacțiune 1/r. Și iată două metode pe care le-am menționat, una care implică câmpul electric, focalizarea izoelectrică, care determină pH-ul la care sarcina este neutră și nu există mișcare netă. În cromatografia cu schimb de ioni , avem o fază mobilă și o fază solidă. Și încărcarea intră proeminent în asta. Mărimea este ceva care va fi o temă recurentă în seara asta, unde vom vorbi despre masa complexelor de proteine, masa subunităților individuale de proteine și masa peptidelor desprinse din acele subunități de bază. Și puteți vedea că există destul de multe metode diferite. Viteza de sedimentare va fi una pe care o vom folosi -- electroforeza și așa mai departe. Solubilitatea și hidrofobicitatea Voi combina aici ca proprietăți, un fel de proprietăți în vrac ale compoziției de aminoacizi a peptidelor și proteinelor. Și se referă la afinitatea lor pentru fazele solide hidrofobe sau fazele mobile hidrofobe , solvenți și așa mai departe. Semnificația biologică a hidrofobicității ar putea fi afinitatea pentru straturile duble lipidice sau afinitatea pentru alte plasturi hidrofobe ale altor proteine. Acum, avem... dimensiunea ne spune ceva despre stoichiometria interacțiunilor proteină-proteină atunci când ne uităm la măsurile native ale mărimii complexelor. Și alte indicii ale legării specifice, fie că este vorba între proteine sau o proteină dintr-o moleculă mică, pot fi detectate prin cromatografie de afinitate sau altă metodă înrudită ca precipitarea [INAUDIBILĂ], în care veți avea un ligand, ca un anticorp, care este specific pentru un anumit epitop proteic și va trage în jos toate proteinele care sunt asociate cu acel epitop, acea proprietate de suprafață. Și o altă metodă de sedimentare - acum, prima metodă de sedimentare a fost o metodă de viteză, o metodă cinetică, în care particulele cele mai mari , odată ce luați în considerare densitatea plutitoare, toate celelalte lucruri fiind egale, particulele cele mai mari se vor sedimenta cel mai repede. Dacă o configurați astfel încât lucrurile să fie aproape la fel de plutitoare și construiți un gradient de densitate prin câmp centrifugal, atunci obțineți particule care se separă după proprietățile lor, care pot include legarea ionilor metalici, care afectează foarte mult densitatea acizilor nucleici, de exemplu, și, prin urmare, complecși proteici de acid nucleic. Acum, aceasta este o pereche deosebit de minunată. Și din punct de vedere istoric, figurează proeminent în proteomică. Este încă destul de viabil. Și ilustrează câteva puncte importante. Când vorbim despre masa unei proteine ​​native sau a unei proteine ​​care a fost denaturată de o micelă de detergent, cum ar fi dodecilsulfatul de sodiu, SDS, masa sa poate fi rezolvată prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă destul de puternică , unde se cerne, unde gelul. provoacă cernerea. Și această micelă, această dimensiune a micelului de detergent în sine, sau micela este dependentă de dimensiunea lanțului proteic desfășurat sau parțial desfășurat . Și astfel obțineți de fapt o diagramă calibrabilă destul de bună a masei proteinei față de mobilitatea într-un câmp electric atunci când proteina se înglobează în această micelă de detergent. Deci, această observație a potențialității acestui detergent de a denatura proteinele și apoi de a se rezolva pe baza masei, cu mici excepții ale proteinelor foarte hidrofobe sau proteinelor foarte bogate în carbohidrați - majoritatea celorlalte proteine ​​vor avea o relație foarte bună de calibrare . În mod similar, sarcina unei proteine se apropie de 0 pe măsură ce pH-ul ajunge la punctul în care titrează toate grupurile de tip titrabile. Și asta se poate calcula. Și rezoluția acestui lucru este de aproximativ 1 parte din 100 sau mai bună. Deci ambele împreună sunt două metode de rezoluție foarte înaltă. Și vă puteți gândi să încercați să împărțiți... aveți un amestec complex de proteine. Vrei să-l împărțiți în o mulțime de coșuri separate, poate 100 din fiecare. Și dacă combinați două dimensiuni, așa cum faceți adesea aici, unde veți rula mai întâi izoelectric și apoi a doua dimensiune SDS, acum aveți 100 de containere într-o singură dimensiune și fiecare dintre acele coșuri se transformă în 100 de containere în a doua dimensiune. . Deci, teoretic, aveți de ordinul 10 până la al patrulea container. Și dacă unele dintre lucrurile pe care doriți să-- unele dintre proteinele rare pe care doriți să le analizați sunt într-unul dintre acele coșuri, s-ar putea să fi obținut până la o îmbogățire de 10 până la a patra ori pentru acele proteine ​​rare. altele mai comune, care sunt prea ușor de dat peste cap. Acum, înainte de a ajunge la un exemplu real despre gel bidimensional, vreau să motivez acest lucru prin componentele computaționale ale acestuia și biologia computațională pe care o puteți obține din aceste separări multidimensionale. Și asta vine din interesul nostru recurent de a compara ori de câte ori putem calcula o proprietate a unui sistem, sau în acest caz a unei proteine, facem acest lucru și o comparăm cu observațiile. Și unele dintre proprietățile aici sunt localizarea în celulă, care este în esență o asociere a proteinei așa cum este făcută, modificările post-sintetice ale proteinelor, cum ar fi proteoliza și fosforilarea și așa mai departe, încărcătura și masa acesteia. . Și aici este prezentat un grafic al sarcinii calculate sau punct izoelectric în unități de pH. P fiind logaritmul negativ al concentrației ionilor de hidrogen . Deci se calculează pe axa orizontală și se observă pe axa verticală. Și ceea ce vedem aici este că dacă aici ar exista o relație perfectă x egal și , unde calculate și observate sunt aceleași, atunci toate punctele s-ar afla pe această linie și, deși valorile aberante, inițial erau lucruri precum deplasările de cadre. a secvenței ADN, producând o proteină calculată greșit. Odată ce acestea au fost corectate, apoi s-au observat clivajuri proteolitice, care puteau fi cartografiate prin aminoacidul exact, iar apoi cele mai corectate câteva pe linie. Iar resturile au fost alte modificări post-sintetice, cum ar fi fosforilarea. Așa că iată un motiv pentru a-ți accepta valorile aberante. Fiecare dintre aceste lucruri este o poveste interesantă, în care fie aveți o corecție la un tip de date anterior, fie o nouă descoperire a unei modificări post-sintetice. Acum, cum calculăm de fapt toate aceste fapte despre proprietățile proteinelor? Unele dintre acestea au o semnificație biologică, pe care am enumerat-o. Acolo unde se află în celulă, evident, contează pentru îndeplinirea funcției sale. Cât de mare este determină ce alte proteine ​​sunt asociate și așa mai departe. Deci cum calculăm asta? Încărcarea proteică care a fost în diapozitivul precedent este o funcție liniară simplă în care însumați pKa-urile fiecărui aminoacizi individuali. Acum, pKa, din nou, p înseamnă logaritm negativ, iar Ka înseamnă constanta de asociere de echilibru a protonului cu fiecare dintre aceste reziduuri încărcate. Deci, în funcție de pH, există o mare varietate de pH-uri aproape fiziologice în care [INAUDIBIL] și histidinele vor fi încărcate pozitiv, cele albastre și cele roșii pot fi tirozină și cisteină. În special, aspartatul și glutamatul pot fi încărcate negativ în intervalul de pH pe care l-am văzut în diapozitivul anterior. Și astfel, aceasta este calculată ca acea sumă simplă. Și masa proteinelor este calibrabilă cu cunoscute. Chiar dacă aveți o relație empirică foarte complexă, cum ar fi electroforeza pe gel FBS care leagă detergentul. Sună foarte... prea multe piese mobile pentru a fi complet teoretic. Dar dacă îl calibrezi cu proteine ​​bine cunoscute sau cu complexe proteice dacă faci o electroforeză nativă sau o viteză de sedimentare nativă, atunci poți obține o curbă în care poți interpola și găsi mase destul de precis, sau cel puțin aproximativ 2%. Dar spectrometria de masă se aplică în mod obișnuit maselor de peptide, uneori maselor de proteine ​​întregi. Și aici, presupunând că spectrometrul de masă este calibrat corespunzător și așa mai departe, aceasta este o simplă sumă de izotopi. Și acest lucru poate fi realizat uneori până la patru sau șase cifre semnificative. Și într-adevăr este o simplă sumă a izotopilor măsurați de fizică. Și aceasta poate include modificări post-sintetice. Pe măsură ce treceți la peptide, modificarea post-sintetică devine un efect fracțional mult mai mare asupra măsurilor pe care le faceți. Nu numai masa, ci și proprietățile cromatografiei lichide ale unei proteine sau ale unei peptide pot fi calculate. Aici luați compoziția de aminoacizi și faceți regresia liniară pe un set de calibrare. Și puteți obține o precizie de ordinul a 5% sau mai bine. Un subset de localizare, avem motive. Uneori, hidrofobicitatea este o parte a acestor motive în descrierea lor. Exprimarea nu ar fi ceva -- am văzut motivele care sunt implicate în reglarea transcripției și așa mai departe. Dar un fel de scurtătură care te-ar putea duce direct acolo în anumite cazuri este indicele de adaptare a codonilor. Acesta este ceva în care ipoteza este că poți merge direct de la secvența de nucleotide a unei regiuni de codificare a proteinei și, dacă folosește codoni care sunt foarte abundenți, care corespund unor ARN de transfer foarte abundenți, atunci acea proteină - atunci asta înseamnă că Presiunile evolutive care produc acea alegere specială de codoni dezvăluie faptul că acea proteină va avea o abundență mare. Deci, într-un fel, acesta este un mod de a merge direct fără... datorită acestei observații și așteptărilor oarecum logice. așa că Acum avem tot felul de metode de separare și motivație pentru a le studia, mai mult decât doar folosirea lor. Dar acum vrem să ne uităm la un caz particular de separare. Vorbim despre complexe și localizarea proteinelor. Deci, acesta este un alt exemplu de gel bidimensional, unde punctul izoelectric este pe axa x aici, iar axa verticală este această estimare a masei moleculare, oferită de asocierea proteinei cu miceliile SDS și efectul asupra electroforeză cu gel. Și acesta este un gel 2D, o mică secțiune a acestuia, nu gama completă de pH și nici gama completă de greutate moleculară, dar acesta are o bună parte din proteinele care sunt secretate. Acum, în ce măsură putem calcula asta? Am arătat o serie de calcule și observații până acum. Și am subliniat în ultima clasă că, într-o oarecare măsură, regiunile transmembranare ale unei proteine ​​ar putea-- acesta este unul dintre algoritmii mai buni în analiza secvenței proteinelor . Și făcând acest pas mai departe, puteți spune de fapt, OK, știm că acesta ar putea avea un motiv sau două care interacționează cu membranele sau, cumva, fac parte din procesul prin care proteinele sunt țintite și se deplasează prin membrane, astfel încât să vă puteți diviza. în mai multe localizări subcelulare diferite - în eucariote, localizarea mitocondrială și cloroplaste în plante, proteine ​​secretate care trec până la capăt prin membrana plasmatică și alte locații, cum ar fi în interiorul membranei. Și aceasta poate avea o rată de succes de 85%, adică un fals negativ de 15%. Și aici puteți vedea false pozitive modeste, peste predicții în 295 de transmembrane. Deci să revenim la masă și de data aceasta în contextul spectrometriei de masă. Ce avem... care este punctul nostru de plecare? Ei bine, dacă te uiți în partea stângă a diapozitivului 11, vei vedea cel mai simplu dintre atomi, hidrogenul, și te-ai aștepta să aibă o masă atomică de 1. Ei bine, deoarece se presupune că carbonul-12 este exact. 12, se dovedește că hidrogenul nu este exact 1 când îl măsori de fapt. Și nici măcar nu este suficient de bun pentru standardele guvernamentale. Când, să zicem, adăugați un CH2, se adaugă până la 14. Și acesta poate fi discriminat de un azot-14 cu un spectrometru de masă suficient de bun. După cum se dovedește, pentru majoritatea analizelor biochimice-- proteine, nu depinzi de a șasea virgulă zecimală. Poți scăpa, într-adevăr, cu... sau cu siguranță nu depinzi de a avea ca rezoluție de la 10 la minus trei unități de masă atomică. Dar depinzi de mult-- într-o peptidă de mărime kilodalton să poată obține 1 parte din 10 până la a patra, 1 unitate de masă atomică. O altă considerație importantă aici este că nu numai că aceste lucruri nu sunt exact numere întregi, dar în abundență naturală, ele sunt un amestec de izotopi majori din extrema stângă și al doilea și uneori al treilea și al patrulea izotopi stabili, de obicei izotopi neradioactivi, care sunt prezente în natură. Și cel mai abundent din această listă este C13. Și este cel mai abundent în două sensuri. Una este că este cea mai mare abundență fracțională dintre oricare dintre aceste elemente. Și în al doilea rând, carbonul în sine este foarte comun în peptide. Dacă vă scindați proteina cu tripsină, care scindează c-terminalul la lizine și arginine, veți obține de ordinul a 10 sau 20 de aceste peptide per proteină. Și ar putea avea o lungime de 10 aminoacizi. Și astfel ar putea avea în ele de ordinul a 40 de carboni. Așa că acum abundența fracționată a C13 cu 40 de atomi de carbon se apropie de unitate. Și vom vedea un exemplu exact despre cum se desfășoară acest lucru în ceea ce privește multiplele combinații de izotopi care pot apărea. Sulful, pe de altă parte, are izotopi mai stabili. Are patru izotopi stabili diferiți, dar fiecare este o fracție destul de mică. Și probabilitatea de a avea un sulf într-o anumită peptidă este scăzută. Adică, asta e probabilitatea de a avea un sulf. Probabilitatea de a avea 40 de sulf este extrem de mică. Așa că am trecut prin calculul acestei mase încărcate. Acum vom face cromatografie lichidă, în special măsuri hidrofobe. Și toate acestea se încadrează sub titlul cromatografiei lichide de înaltă performanță , care este realizată sub presiune înaltă, de obicei, pentru ca aceasta să meargă rapid. Și astfel vei avea aceste mici... îți vei digera proteinele cu tripsină. Obțineți o serie de aceste peptide, să zicem, aproximativ 10 aminoacizi. Și apoi sunt injectate într-o fază lichidă. Se leagă de faza solidă prin proprietățile hidrofobe. S-ar putea să-l ai. Și apoi veți avea o citire, în care, în funcție de timp, obțineți abundență în care vârfurile pot fi măsurate prin numărare de masă sau de ioni și așa mai departe. Și acestea pot fi colectate sau pur și simplu executate într-un spectrometru de masă. Vor fi două faze -- faza mobilă și faza solidă. Vorbind despre faza mobilă mai întâi, tendința hidrofobă a oricărei peptide date va fi într-un fel legată de suma componentelor individuale de aminoacizi. Și puteți avea fie o eluție izocratică, în care aveți practic o viteză de migrare constantă, nicio modificare a conținutului fazei mobile, fie puteți avea faza mobilă să își schimbe compoziția, să zicem, pentru ceva care este aproape în întregime apă la început. ceva care are un conținut organic ridicat, până la 40% sau cam acetonitril, și astfel încât, la sfârșitul gradientului, chiar și cele mai hidrofobe peptide au acum la fel de multă afinitate pentru faza mobilă ca și faza solidă și vin curgând. oprit. Faza solidă are o serie de opțiuni diferite. Principala despre care am tot vorbit , cel puțin implicit, este faza inversă, în care aveți lanțurile hidrofobe de carbon-18 alchil imobilizate într-un mediu foarte poros într-o coloană care poate rezista la presiune mare. Sau poate avea polarități diferite, excluderea mărimii, același fel de lucruri despre care vorbeam cu electroforeză, cu excepția faptului că acum forța este un câmp neelectric, dar este pur și simplu presiunea diferențiabilă între portul de injecție și ieșire. Așadar, iată un exemplu de caz specific despre modul în care calculați afinitatea unei peptide față de o coloană hidrofobă. Aceasta este o coloană C18, care se referă la numărul de atomi de carbon din lanțul alchil. Deci puteți vedea că aceasta este ca un fel de fază de tip lipidic. Este genul de lucru pe care l-ați putea vedea în mijlocul unei membrane cu două straturi lipidice. Și în această diagramă, aveți un timp relativ de retenție de-a lungul axei verticale. Și numărul de reziduuri se referă la peptide scurte scindate, un fel de mers de-a lungul proteinei. Acestea au fost sintetizate, astfel încât marșează de-a lungul proteinelor, foarte analog cu modul în care, într-o clasă anterioară, Rosetta a făcut oligonucleotide sintetice care marșează de-a lungul genomului uman. Și acest lucru a fost făcut pentru a calibra pentru a vedea cum compoziția, compoziția de aminoacizi a unei peptide ar putea afecta mobilitatea acesteia și vă permite să o calculați. Așadar, ceea ce ajungeți aici este un mod oarecum intuitiv de a însuma contribuțiile fiecăruia dintre acești aminoacizi. Acum, amintiți-vă, acest lucru se face în condiții destul de acide. Deci, grupările acide încărcate normal vor fi acum protonate și vor fi neutre. Și așadar, ceea ce vom găsi este în principal un spectru de la cele mai lente de eluat. Ele necesită cel mai organic și, prin urmare, cel mai mult-- cel mai lung timp de retenție ar fi aromaticile extrem de hidrofobe , triptofanul și fenilalanina, au o componentă pe care o obțineți prin regresia liniară a fiecăreia dintre aceste peptide. Știți secvența acestor peptide. Calculați vectorul lor de compoziție. Și apoi îl raportați la timpul de retenție care este observat, astfel încât graficul inferior să fie cel observat. Și apoi, după ce faci regresia, obții un set de acești coeficienți. Acum le puteți conecta într-un sens aditiv pentru a face acest complot calculat. Și puteți vedea că există o corelație foarte bună în sus și în jos. Ar fi fost mai bine dacă acești autori ar fi făcut acest lucru ca o diagramă de calculat versus observat, așa cum am făcut în cel precedent, și apoi ar fi arătat împrăștierea și au făcut o curbă de regresie. Dar înțelegi ideea. Și astfel cele mai hidrofobe sunt în vârf, iar cele care sunt condiții acide sunt cele mai încărcate. Sunt cele cu sarcină pozitivă, lizina, histidina și arginina aici jos, în partea de jos, și cele acide, deoarece sunt aproape de neutre sau aproape de 0 aici. Și există un efect ușor dacă aminoacidul este la capătul N-terminal sau nu. Așa că acum am calculat comportamentul în fază inversă aici, în partea stângă a diapozitivului 17. Și aceasta este separată de hidrofobicitate, iar apoi avem masa, pe care am subliniat cum puteți calcula masa. Deci acum puteți calcula atât hidrofobicitatea sa pe axa verticală, cât și masa pe orizontală. Și puteți face acest lucru, în computer, acest complot bidimensional. În acest caz, acestea sunt de fapt date observate. Dar i-ai putea suprapune si pe cele calculate. Acestea sunt puțin mai striate în timpul de retenție în faza inversă , rt, doar din cauza scării pe care o folosește sau a proprietăților metodei de separare. Acum, dacă aruncați în aer... dacă luați una dintre aceste mici puncte bidimensionale și măriți pe el și îl priviți mai în detaliu, vedeți că de fapt este un set complex de vârfuri în direcția masei și destul de simplu în timpul de retenție. Acum, ați putea spune, ei bine, poate acestea sunt toate peptide diferite. Dar de fapt... și sunt, într-un anumit sens. Dar sunt rude banale ale asta, unde trebuie să te gândești, unde poți să-mi dai date și să obții informații suplimentare. Deci, fiecare dintre acestea sunt vârfuri izotopice separate, ceea ce înseamnă, amintiți-vă, aceasta ar putea avea 40 de atomi de carbon în această peptidă. Și așa va fi o distribuție binomială, unde acesta este cazul în care aveți zero carbon-13. Cu alte cuvinte, toate sunt carbon-12. Și apoi următorul vârf din dreapta va avea un carbon-13. Următorul vârf peste va avea două carbon-13. Și n minus 2, unde n este numărul total de atomi de carbon din acea peptidă, care ar fi carbonul-12, cel mai abundent și așa mai departe. Și veți obține toate combinațiile posibile într-o distribuție binomială așa cum v-ați aștepta. Acum, ce spune asta? Îți spune cel puțin două lucruri. Una este distanța dintre acestea, puteți vedea aici, este o jumătate de unitate de masă atomică. Ei bine, cum obținem jumătate dintr-o unitate de masă atomică? Adică, ar trebui să fie... Adică, știm că nu sunt numere întregi perfecte, dar asta e departe. Și motivul este că ceea ce se măsoară de fapt este masa peste sarcină. Nu măsori masa... masa peste sarcină. Și așa se spune că această peptidă are o stare de încărcare +2. Acesta este un fapt important. Va fi greu să-i interpretați masa dacă nu îi cunoașteți încărcătura, pentru că m/z este măsurat. Celălalt lucru care se măsoară este din distribuția binomială exactă, puteți obține o estimare a numărului de atomi de carbon de acolo, pentru că dacă sunt un număr mare de atomi de carbon, atunci se va dovedi că unul dintre vârfurile secundare de aici, unul dintre vârfurile din dreapta, vor fi de fapt cele mai abundente. Dacă are un număr mic de carboni, atunci vârful zero carbon-13 va fi câștigătorul total. Și astfel, din înălțimile relative de 0, 1 și 2, puteți estima numărul de atomi de carbon. Deci două fapte pe care le puteți obține din această vedere de înaltă rezoluție a acelui vârf. Deci acum avem aceste două faze, aceste două dimensiuni destul de bine în mână -- faza inversă și masa. Acum vom adăuga o altă dimensiune - de fapt, încă câteva dimensiuni. Una este o altă dimensiune peptidică, care este un schimb puternic de cationi, SCX. Ceea ce înseamnă aceasta este că peptidele vor avea proprietăți cationice diferite , sarcini diferite și se vor lega la aceasta în grade diferite. Și le puteți pune în tandem, fie fizic, fie conceptual. Vei rula una, vei lua o grămadă de fracții și apoi o vei pune în faza inversă. Prima fază este literalmente conectată fizic la spectrometrul de masă. Și apoi vom vorbi despre unele din amonte. Acum, metodele de separare din amonte, înainte de a o fragmenta în peptide, puteți separa. Poate avea dimensiuni asupra proteinelor, ceea ce vă poate spune despre complexe. Să trecem printr-un exemplu specific de complexe. Deci, dacă luați întregul proteomul de drojdie - măcinați drojdia, aruncați-o pe o primă separare, care este viteza de sedimentare - amintiți-vă, există echilibru și viteză. Viteza răspunde în principal la dimensiunea complexului. Aceasta este o dimensiune nativă. Nu denaturam cu SDS nativ. Și așa vei vedea lucrurile care merg absolut cel mai repede în celulă și printre cele mai abundente sunt ribozomii și subunitățile ribozomale. Acest lucru se face în condițiile în care doar depărtați cele două subunități ribozomale, astfel încât acestea să fie separate. Iar cel mai mare dintre cei doi se numește 60S. S se referă la Svedberg, care a fost unul dintre pionierii vitezei de sedimentare. Și acest lucru poate fi corelat. Rata cu care scade, acest câmp centrifugal cu gradient stabilizat este legat de complex. Și apoi, aceasta este prima dimensiune pe orizontală, sedimentarea. Axa superioară care merge orizontal este sedimentarea. Și apoi scade electroforeza pe gel SDS. Deci acum luați aceste complexe native și le descompuneți în proteinele lor componente, unde greutatea moleculară mare este crescută și greutatea moleculară scăzută este scăzută. Și puteți vedea că există un număr destul de mare de proteine în fiecare dintre aceste două subunități, 60S și 40S. Acum, fiecare dintre aceste proteine... deci asta este a doua dimensiune. Acum, îl descompuneți în peptide și analizați peptidele după timpul de retenție în toate cele trei dimensiuni - schimb puternic de cationi, timp de retenție și masă. Și apoi adaugi un al patrulea, pe care îl vom dezvolta puțin mai târziu, în care poți de fapt descompune peptidele în bucăți mici. Deci identificați din ce proteină provine fiecare dintre peptide. Acum, din păcate, nu toate peptidele sunt egale ca potențial de ionizare. Și așadar, dacă ionizează slab, nu vei detecta o anumită peptidă dintr-o proteină. Dacă detectezi un număr mare de peptide dintr-o proteină, asta înseamnă probabil că aceasta este abundentă în proba sau fracția ta și înseamnă, de asemenea, că poți crede că identificarea computerizată a acelei proteine este probabil destul de solidă. Deci, dacă obțineți cinci sau mai multe peptide dintr-o anumită proteină în căutarea în baza de date - și vom vorbi doar un moment despre cum faceți acea căutare în baza de date - atunci credeți asta și este foarte solid. Și deci, dacă te uiți la-- poți vedea că toate acestea-- când te uiți la amprenta proteică pentru fiecare dintre fracțiunile 60S din sedimentare, ele arată destul de asemănătoare. Și când epuizați specificațiile de masă, obțineți seturi similare de semnături de peptide. Și ele corespund... cele mai multe dintre ele, în special cele mai abundente, corespund proteinelor cunoscute 60S. Dacă mergi puțin mai încet, cu o masă mai mică, subunitățile 40S și analizezi subsecvențele semnăturilor spec. de masă pentru acele peptide, atunci ele cresc în principal cu 40S. Există câteva excepții în ambele. Există și alte categorii, care pot fi interesante. Cel mai interesant din acest studiu special, au subliniat autorii a fost [? Weimer?] 116p, care, nu uitați, acesta este un domeniu foarte matur. Acesta este un studiu foarte recent. Și ribozomii au fost foarte bine caracterizați. Și cred că am înțeles că cel puțin în sistemele microbiene, cum ar fi E. coli și drojdie, înțelegem cu adevărat toate proteinele necesare pentru a face un zumzet ribozom. Dar aici a fost o nouă proteină ribozomală, care de atunci a fost confirmată că aceasta este o parte autentică a subunității 40S. Puteți vedea aici că a avut multe hit-uri de peptide. Deci a fost egală din abundență cu celelalte proteine ​​din subunitatea 40S. Deci aici am avut într- un anumit sens cinci sau cam asa ceva dimensiuni, sedimentarea, care este dimensiunea complexului nativ , dimensiunea subunității proteice denaturate, peptida ionică - schimbul de ioni, masa peptidei și fragmentarea peptidei. Deci, când vorbim despre fragmentare, asta înseamnă uneori MS/MS . Înseamnă că faci prima separare în masă a peptidei. Îl spargi și faci o altă separare în masă a părților componente. Și asta ne permite să facem căutarea în baza de date și secvențierea peptidelor. Acum, cum funcționează asta... aceasta este o explozie a ceva care a fost într-un diapozitiv anterior, unde puteți vedea cu adevărat regiunea în care aveți electrospray. Vom avea o lovitură și mai strânsă cu asta într-o clipă. Dar, practic, cromatografia ta lichidă în fază inversă merge direct în acest vid aici, generând puțin spray la 4.000 de volți, iar apoi acești ioni moleculari vor trece prin vid printr-o serie de octopoli magnetici până când lovesc o capcană de ioni, ceea ce te ajută să determinați m/z și, în final, un detector. Puteți vedea că există o varietate de presiuni diferite aici, un fel de presiune în creștere din punctul în care solventul apos merge până la detector, care este cel mai mare vid la aproximativ 10 la minus cincilea torr. Acum, aici este locul în care spectrometria de masă [INAUDIBILĂ], sau MS/MS, sau disocierea indusă de coliziuni , aveți... iată fasciculul vostru de ioni de peptide moleculare. Acum ai transformat peptidele în... ele sunt fiecare în spațiul lor mic. Și în mijlocul acestui cvadrupol, al acestui mediu magnetic de aici, aduci un gaz inert, precum argonul, pentru a se ciocni cu acești ioni care se mișcă rapid și ei vor rupe lanțul, practic, la orice legătură covalentă. Și dacă te gândești la peptida de la coloana vertebrală a lanțului ca având trei legături covalente diferite , există legătura peptidică în sine, apoi există o legătură carbon-azot și o legătură carbonil-azot-- îmi pare rău-- și o legătură carbon-carbon. Se poate rupe în oricare dintre aceste trei poziții și apoi veți genera un set de fragmente care vin de la capătul N-terminal cu trei posibile fragmente C-terminale. Și venind, dacă un C-terminal se desprinde în același punct, întreaga serie vine în acest fel. Și pe măsură ce intri de la capătul N-terminal, îi dai A, B și C, în funcție de dacă se rupe la legătura C carbon-carbon , legătura carbon-azot sau legătura azot-carbon, A , B și, respectiv, C. Și aceleași care vin de la capătul C-terminal se numesc Z, Y și X. Și așa, după cum se dovedește, doar empiric, dacă sortați toate elementele chimice, în cele mai multe cazuri, legătura peptidică este cea care este despicat cel mai activ. Și astfel, ionii B și ionii lor complementari Y domină imaginea. Acum, ceilalți vor fi prezenți. Mai ales dacă provin dintr- o peptidă foarte abundentă, pot schimba ionii B și Y cu o peptidă mai puțin abundentă. Dar toate celelalte lucruri fiind egale, B și Y vor domina, iar cea mai mare parte a restului discuției va fi despre acestea. Aceasta este cea mai apropiată imagine pe care o vom arăta cu etapa de ionizare. Aceasta este o etapă, care nu a fost suficient de amănunțită studiată, în sensul că această etapă de ionizare, în care picăturile de solvent apos și organic care ies din coloana de separare sunt supuse vidului. Apa începe să fie eliberată din picătură. Protonii... amintiți-vă, acest mediu acid se asociază cu un ion molecular. Ele explodează pentru că există prea multă sarcină pozitivă într-un spațiu mic, până când în sfârșit aveți un ion molecular asociat cu una sau două sarcini pozitive nete. Amintiți-vă, am avut un exemplu cu puțin timp în urmă. Am avut o sarcină pozitivă netă de +2. Nu trebuie să ai neutralitate în această situație. Oricum, acest lucru este prost înțeles în sensul că unele peptide ionizează mult mai bine decât altele. Și vom reveni la asta când vom vorbi despre cuantificare. Dar deocamdată, ceea ce vrem să facem este să ne întrebăm cum analizăm spectrele complexe care iese la iveală atunci când fragmentezi-- când iei-- mai întâi, obții un spectre destul de simplu, care este doar o listă a tuturor maselor. a tuturor peptidelor. Și amintiți-vă, unii vor fi slabi, iar alții vor fi puternici din cauza acestei ionizări voodoo. Dar apoi le spargem. Cu toate acestea, indiferent de intensitatea peptidei originale , aceasta va produce o grămadă de ioni fiice, care vor fi ionii B care vin de la capătul N-terminal, ionii Y de la capătul C-terminal. Și veți avea acest amestec mare, un set imbricat, care devine din ce în ce mai mare pe măsură ce vă îndepărtați de capătul N-terminal și seria de ioni B și complementele lor. Și suma ionului B cu ionul său Y complementar trebuie să fie masa moleculară inițială corectată pentru chimia care are loc chiar la clivaj. Și deci iată un exemplu real. Îl vom analiza, astfel încât să puteți vedea ce se întâmplă cu o peptidă tipică aici, în colțul din dreapta sus. Și aceasta este spectrometrie de masă în tandem. Amintiți-vă, există o... dacă vă gândiți bine, a existat o singură peptidă de masă care a fost apoi divizată în toate aceste bucăți mici. Și peptida aproape intactă se va afla la capătul îndepărtat al axei orizontale, care este axa de masă, aproape de 1.200 de unități de masă atomică. Și apoi o abundență relativă este axa verticală, deoarece este legată doar de numărul de ioni. Și puteți vedea că există unele variații aici. Acest lucru nu se datorează ionizării. Acest lucru se datorează eficienței de clivaj, scindarea la fiecare dintre legăturile pentru seria Y, care este în albastru aici. Și tinde să fie vârfurile mai înalte, iar seria B în roșu, care tinde să fie vârfuri puțin mai joase. Și apoi aveți aceste săgeți mici, săgețile mai întunecate indică seria de ioni Y care separă două vârfuri adiacente. Pentru că ceea ce este diferența dintre aceste două vârfuri este adăugarea unui aminoacid. Și astfel, concentrarea asupra seriei albastre, ionii Y care vin de la capătul C-terminal, cel mai scurt Y, Y1, ar fi doar aminoacidul C-terminal în sine, care ar fi arginina. Și distanța sa de la origine ar fi aproximativ masa argininei în sine. Și apoi adăugați o glicină, care este o deltă mică, apoi o alanină, o izoleucină și serină și așa mai departe. Și aici puteți vedea foarte clar leucina și asparagina și valina, astfel încât seria de ioni Y până în jos. G este ultimul documentat. N și S la cea mai mare greutate moleculară nu sunt vizibile. Și de fapt, multe dintre aceste lucruri vei avea vârfuri foarte slabe. În esență, veți avea vârfuri lipsă care corespund unuia dintre aminoacizii delta. Deci, în acest caz, distanța dintre cele două vârfuri proeminente va fi de doi aminoacizi. Puteți vedea că aceasta începe să devină o problemă provocatoare de recunoaștere a modelelor, deoarece aveți toți ionii B amestecați cu ionii Y. Și acest lucru este rezumat în următorul diapozitiv. Ionii B sunt amestecați cu ionii Y. Și unii dintre ioni lipsesc. Fiecare ion are mai multe forme izotopice. Acest lucru nu a fost atât de evident în diapozitivul precedent. Dar acea explozie pe care am arătat-o ​​cu ceva timp în urmă, ai avut distribuția binomială. Există prezența persistentă a ionilor de tip A, C, X și Z, unde aveți clivarea unora dintre celelalte legături. Ionii pot pierde o apă sau un amoniac. Ai zgomot de la alte peptide și de la contaminanții din sistem. Și aveți modificări de aminoacizi, care nu sunt un contaminant sau un lucru rău. Este un lucru bun. Acesta este ceea ce cauți. Dar acestea pot fi în urme în acest sistem. Acum, există două moduri de a aborda cantitatea uimitoare de date pe care o puteți obține din acestea. Amintiți-vă, toate aceste dimensiuni multiple se termină în sfârșit în această pădure de ioni B și ioni Y și tot restul ei acolo. Și există două abordări. Una este că o vom numi secvențierea de novo a peptidelor, care ar fi analogă cu secvențierea de novo a ADN-ului pe care o făceam, iar cealaltă este că, dacă îmi spui secvența, o voi găsi în jocul meu de date, OK, este Făcând o căutare în baza de date în care ești limitat la proteine ​​care sunt foarte, foarte... la găsirea de peptide despre care știi deja sau despre care poți ipoteza dintr-o secvență de genom. Deci aceasta este prima categorie. Aceasta este secvențierea de novo. Și preia toate provocările din slide-ul anterior. Acceptă posibilitatea de a lipsi date pentru o anumită specie de ioni despre care credeți că ar trebui să existe, dar din anumite motive nu sunt scindate eficient de argon în asocierea indusă de coliziune. Și ia în considerare faptul că trebuie să aveți un set de ioni B, un set imbricat de mase de la capătul N-terminal care trebuie să fie complementare cu acest set imbricat pe care îl primiți venind de la capătul C-terminal. Deci aceasta este programare dinamică. Și probabil că puteți număra de câte ori am realizat un algoritm de programare dinamică în această clasă. Și să sperăm că ești fericit că ai făcut cel puțin una dintre ele manual. Și pe acesta nu ne vom ocupa, dar aici puteți vedea cum se mapează conceptual cu cel mai simplu despre care am vorbit la început, care este compararea a două secvențe de aminoacizi. Acolo, indelurile au fost cauzate de schimbarea evolutivă. Aici inserțiile și delețiile se datorează unui ion lipsă din cauza clivajului ineficient în faza gazoasă. Acest lucru este complicat și mai mult de necesitatea de a secvenționa în esență atât din B, cât și din Y simultan și să vă asigurați că aveți cea mai bună combinație de sarcini B și Y. Deci aceasta este secvențierea de novo. Acum, în diapozitivul 29, avem alternativa, care este mult mai frecvent aplicată, un exemplu de alternativă, adică spuneți-mi o secvență. O voi găsi în datele mele, [INAUDIBIL].. Și unde, practic, calculezi spectrul la care te-ai putea aștepta pentru fiecare peptidă la care te-ai putea aștepta într-un genom. Deci, practic, folosești genomul pentru a prezice regiunile de codificare a proteinelor. Folosiți-le pentru a face digestia in silico cu tripsină, practic scindați după fiecare lizină și arginină și poate după altele sunt reguli complicate în care tripsina nu se scindează întotdeauna după lizină și arginine. Și uneori vor fi prezente și alte proteaze. Și trebuie să ții cont de acestea. În orice caz, generați un set virtual de peptide. Generați un set virtual de vârfuri de masă. Acum, din moment ce nu cunoaștem regulile care determină înălțimea acelor vârfuri de masă, ne-am dori să le facem, dar nu știm, așa că am stabilit-o la o unitate, la unele arbitrare pentru a le face pe toate la fel. Deci nu veți obține un coeficient de corelație excelent bazat pe înălțimi, ci doar dacă există sau nu. Și asta faci este de fiecare dată când ai o lovitură între spectrul tău prezis și celălalt, indiferent de intensitatea celuilalt, așa că ai așteptat intensitatea observată, dar nu ai o intensitate reală calculată. Și acest coeficient de corelare servește ca o modalitate de a prioritiza scorurile. Și dacă aveți un... de foarte multe ori cel mai bun scor va fi rezultatul din baza de date pentru peptida pe care o doriți. Acum, dacă vă așteptați la modificări post-sintetice, trebuie să spuneți algoritmului să adauge masa corespunzătoare la aminoacidul corespunzător. Deci, de exemplu, dacă vă așteptați la o fosfoserină, trebuie să puneți masa de fosfat în program și să o asociați cu o serină. Deci, serina poate fi fie o serină obișnuită, fie o fosfoserină. Deci asta este o altă complexitate acolo. Așa că acum am trecut prin bogăția metodelor de separare. Separarea este strâns legată de a ajunge la un spectru de masă care este suficient de curat pentru a face fie secvențierea de novo, fie căutarea în baza de date. Acum că l-am identificat, să încercăm să o cuantificăm. O putem cuantifica într-unul din două moduri, la fel ca și în cazul ARN-urilor, fie la scară absolută, fie la scară relativă. Ce este implicat? Vom face o analogie cu metodele de cuantificare a ARN, despre care cred că am avut ceva foarte asemănător cu partea stângă a diapozitivului 31 aici, când am vorbit despre ARN-uri, toate modalitățile în care le-am putea cuantifica. Un subset dintre acestea au un analog în domeniul proteic din partea dreaptă a acestui diapozitiv. Deci, de exemplu, una dintre metodele noastre preferate pe care le-am folosit a fost microarray-urile. Aceasta este linia superioară a ARN-ului. Aici veți avea segmentele genelor, fie oligonucleotide, fie [INAUDIBILE], imobilizate pe un microarray. Etichetați fluorescent ARN-ul și cantitați. Pentru proteine, echivalentul ar fi o matrice de anticorpi care vizează caracteristicile unice ale fiecărei proteine. Acest lucru se întâmplă în primele zile, pentru că suntem limitați în anticorpi. Nu avem anticorpi împotriva fiecărui epitop de suprafață proteică . Și nu sunt suficient de specifice. Există o mulțime de diafonie. Am menționat în a doua linie că micromatricele nu au putut măsura compoziția feliilor alternative sau dimensiunea ARN-ului mesager. Deci, acest lucru a fost cel mai bine realizat printr-un Northern blot, care a măsurat de fapt dimensiunea, dar nu a fost un randament mare. Echivalentul pentru proteine ​​se numește Western. Toate acestea sunt jocuri de cuvinte pe numele lui Ed Southern. Western-urile vă vor permite să măsurați dimensiunea proteinelor native sau denaturante și apoi să le detectați cu anticorpi. Din nou, anticorpi limitati. Dacă am avea o descoperire tehnologică care ne-ar oferi toți anticorpii de care avem nevoie, la fel ca și noi, este ușor să obținem orice acid nucleic dorit doar prin sinteză. Nu există un echivalent real cu PCR pentru o lume a proteinelor. Puteți eticheta proteinele cu acizi nucleici și puteți face PCR pe acizii nucleici. Dar nu există o amplificare reală directă a proteinelor. Construcțiile Reporter funcționează practic la fel pentru fiecare. Aveți ceva foarte specific pentru că l-ați construit in vivo, dar este o sumă a tuturor pașilor de exprimare a ARN și a proteinei care vă oferă reporterul. Hibridizarea fluorescentă in situ în cazul ARN-ului sau a anticorpilor fluorescenți in situ în cazul proteinelor este o modalitate excelentă de corelare a informațiilor cvasi cantitative cu o localizare subcelulară sau suborganismă. Numărarea etichetelor, nu există nimic echivalent pentru proteine, iar spectrometria de masă poate fi utilizată pentru afișare diferențiabilă. Care sunt numărul de molecule pe care le avem? Un parcurs când avem de-a face cu cuantificare-- slide 32, depinde de organism. Unele dintre cele mai simple, cum le găsiți în drojdie, am menționat că moleculele de ARN mesager ar putea fi mai puțin de una pe celulă, doar fluctuații stocastice. Și într-o celulă umană, este probabil o aproximare sau presupunere destul de bună că aproape fiecare nucleotidă din genomul uman poate fi transcrisă. Poate că există o scurgere în care de ordinul a 1 din 10 până la a patra celule vor avea o mică scurgere la orice nucleotidă anume. Deci, acesta este un fel de nivel de fundal. Este de la 10 la minus al patrulea pe celulă. Și este într-adevăr doar detectarea realizabilă cu PCR cu revers transcriptază. Întregul transcriptom al unei celule umane este de ordinul a jumătate de milion de transcripte ARN mesageri. Și așadar, dacă un anume ARN mesager ar ajunge la 10 la al cincilea, ar domina. Și acest lucru se întâmplă în unele cazuri, cum ar fi reticulocitele. Poate 90% din ARN-ul mesager ar putea fi globină. Acum, pentru proteine, veți avea de obicei explozii de proteine. Ai un ARN mesager. S- ar putea să obțineți între 10 și 1.000 de proteine, în funcție de organism. Și astfel aveți de obicei o amplificare corespunzătoare în ultima linie. Acum, când oamenii evaluează întâmplător dacă o anumită metodă este cantitativă sau nu, pot fi intimidați cu ușurință. Deci ei ar putea spune... Am comentat că ionizarea... deci ESI înseamnă Electrospray Ionization în spectrometria de masă. Dacă luați o proteină și o scindeți cu tripsină, în principiu, fiecare fragment de tripsină, deoarece tripsina se scindează destul de aproape de complet destul de ușor, fiecare fragment de tripsină, fiecare peptidă ar trebui să fie echimolară. Dacă acum injectați asta în HPLC, în specificațiile de masă, fiecare intensitate integrată de vârf ar trebui să fie egală, pentru că toate sunt echimolare. Și atunci când descoperi că, nu, ele variază peste două ordine de mărime - adică unele sunt vârfuri de 100 de ori mai intense decât altele -- atunci s-ar putea să te descurajezi și să spui, oh, nu este o știință cantitativă la toate. Nu pot face față unei diferențe de factor de 100. Dar cred că trebuie să reevaluezi asta atunci când oamenii spun că spectrometria de masă nu este cantitativă. Cele două cerințe pentru cuantificare sunt să aveți reproductibilitate și să aveți o modalitate de calibrare sau calcul. Dacă puteți calcula din primele principii, atunci nu aveți nevoie de calibrare. Dacă este prea empiric, atunci aveți nevoie de calibrare. Dar nu este nevoie ca fiecare obiect disparat să se comporte exact la fel. Nu orice peptidă trebuie să dea același răspuns cantitativ trebuie pur și simplu să fie reproductibilă și să fie calibrată cu aceeași peptidă și deci iată un exemplu de stabilire a două exemple la rând de stabilire a reproductibilității aici, acesta este din experimentul cu proteinele ribozomale pe care l-am arătat mai devreme. cu complexele vitezei de sedimentare și multi-dimensiunile. Și aceasta este doar că faci o măsurătoare în prima zi și faci întregul experiment în ziua a doua și apoi compari intensitatea vârfurilor. Și obțineți ceea ce este o relație de linie dreaptă destul de bună pe o curbă log-log peste aproximativ 3 busteni. Au fost multe părți în mișcare în acel experiment. Au fost toate acele dimensiuni diferite. Și întregul experiment nu a fost conceput pentru a fi cantitativ. Nu există controale interne și așa mai departe. Cu toate acestea, acesta este un bun punct de plecare pentru a vă convinge sau pentru a determina dacă ceva este suficient de reproductibil încât să îl puteți face cantitativ. Iată un alt mod de a măsura reproductibilitatea. Acela a fost un coeficient de corelație, un coeficient de corelație liniară pe o diagramă log-log. Iată coeficientul de variație. Cred că s-ar putea să fi menționat asta înainte. Aceasta este doar abaterea standard normalizată de medie. În partea din stânga sus a acestui diapozitiv, puteți vedea că CV-ul sau Coeficientul de variație este doar abaterea standard împărțită la medie. Deci îl puteți raporta în termeni de procente de variație. Deci aici, cu un standard de calibrare a peptidelor, obțineți undeva între 2% și 28% coeficient de variație. Aceasta înseamnă că puteți avea încredere că aceste lucruri se află în intervalul de 2% până la 28% din cantitățile lor absolute atunci când le calibrați. Deci acestea două sunt doar două exemple care ar trebui să vă asigure că există reproductibilitate și că puteți calibra. Calibrarea poate fi o propunere costisitoare. Dar există diverse motivații pentru măsurarea, cuantificarea atât a proteinelor, cât și a acizilor nucleici la scară absolută. Și, de exemplu, ați putea dori să le comparați unul cu celălalt. Ați putea dori să spuneți, în ce măsură este cazul că cele mai abundente proteine ​​rezultă din cei mai abundenți ARN mesageri? Sau vă puteți imagina o lume în care aceștia sunt complet independenți, deoarece unul este factorii de transcripție. Celălalt sunt factorii de traducere. Nu există niciun motiv pentru care acestea sunt neapărat sincronizate. Sau ți-ai putea imagina o ipoteză în care este multă muncă să faci multe proteine și astfel totul trebuie să funcționeze corect pentru cele mai abundente. Iar pentru cele mai puțin abundente, puteți avea puțin mai multă pantă. Deci această analiză criticată puțin în lucrarea ulterioară despre care vom vorbi după ce pauză poate fi interpretată ca fiind consecventă. Când incluzi toate proteinele, ai un coeficient de corelație foarte bun. Acesta este un coeficient de corelație Pearson liniar. Dar pe măsură ce te restrângi la proteinele cu cea mai mică abundență, se destramă. Aveți coeficienți de corelație Pearson mai puțin semnificativi . Deci hai să luăm o mică pauză. Și vom vorbi despre criticarea un pic, îmbunătățirea și întrebarea altor motivații pentru a pune proteinele la scară absolută și a face rapoarte.