NARRATOR: Următorul conținut este furnizat de MIT OpenCourseWare sub o licență Creative Commons . Informații suplimentare despre licența noastră și MIT OpenCourseWare, în general, sunt disponibile la ocw.mit.edu. DR. GEORGE CHURCH: Bine, bine ai revenit. Un anunț rapid înainte de a începe. Eu și colegii profesori, ca răspuns la câteva întrebări blânde, am venit cu un plan pentru a vă ușura puțin seturile de probleme și proiectele , oferindu-vă ceva timp. Aruncați o privire pe site și discutați cu colegii dvs. de predare. Dar, practic, nu vor fi probleme în setul șase. Acesta va fi combinat cu setul de probleme cinci și astfel veți avea la dispoziție trei săptămâni întregi pentru a lucra la proiectul dvs. Tripla timpul proiectului. Presupunând că nu ați făcut nimic până acum, ceea ce sperăm că toți ați făcut multe până acum. OK, deci corelam nivelurile absolute ale abundenței ARN mesager în proteina ARN mesager. Și aici, acest studiu a fost supus unei mici critici nu teribil de controversate. Ceea ce vedeți aici este la foarte... dacă aveți proteine ​​din abundență foarte scăzută, s- ar putea să aveți ceea ce pare o corelație. Apoi adăugați câteva proteine ​​cu abundență scăzută, deci aceasta este doar o fluctuație. Și adăugarea de proteine ​​ar trebui să vă îmbunătățească coeficientul de corelație. Dar dacă au o fiabilitate scăzută fie în proteinele scalei ARN mesager, fie dacă nu există o corelație între cele două din motive biologice, atunci coeficientul de corelație ar putea scădea doar la întâmplare. Dar, pe măsură ce adaugi... pe măsură ce te apuci să adaugi toate proteinele, poți fi fie dominat de câteva proteine ​​cu abundență mare care se potrivesc perfect cu aceasta, abundența de proteine ​​​​ARN mesager. Oricum, unele dintre criticile la acest lucru au avut de-a face cu ipotezele care stau la baza coeficientului de corelație liniară Pearson , care, în calcularea semnificației statistice a unora dintre aceste analize din diapozitivul anterior, face o presupunere de bază că aveți o curbă clopot normală sau Gaussiană. . Și nu trebuie să faceți acest lucru pentru a-- varietatea de măsuri de corelație, care nu necesită această presupunere parametrică. Și există teste pentru cât de aproape de normal este o distribuție . Abaterile de la normalitate pot de toate tipurile. De exemplu, puteți avea ceva mai plat sau puțin mai ascuțit decât în ​​mod normal. Puteți să fi înclinat la stânga sau la dreapta și așa mai departe. Unele dintre acestea, cum ar fi deformarea, pot fi corectate printr-o transformare a jurnalului, în care pur și simplu luați logaritmul sau o altă transformare, iar un jurnal fiind de departe cel mai comun și justificat teoretic, iar acum devine normal și apoi puteți face un test statistic. După cum se dovedește, acesta nu este un efect uriaș, dar îl folosesc pentru a sublinia că puteți atunci când le testați, în special la capătul de abundență scăzută al spectrului. Poate doriți să utilizați un test de rang. Și aici este ilustrat un test de rang pe care îl luați dacă aveți, să zicem, două coloane, aceasta este o serie de perechi de intensități de ARN mesager și proteine. Spuneți coloanele X și coloana Y în colțul din dreapta jos al Diapozitivului 37. Și să spunem abundența, abundența absolută pentru proteina X este 1, 6, 6 și ARN-ul Y corespunzător, care ar fi 8, 2, 3 , și 4. Acum, doriți să întrebați dacă se corelează sau nu. Și ceea ce faci este să-i clasați , deci rangul lui X este 1, 3, 3. Iată o departajare-- modul în care faceți față unei egalități este să le acordați tuturor rangul celui din mijloc al seriei din serie. pi. Și obțineți un rang pentru Y, iar numărul total, în acest caz, este 4, și astfel, atunci când aveți rang, scorul testului este practic suma pătratului tuturor diferențelor de rang. Deci diferența de rang aici ar fi 1 minus 4. Ar fi 3 pătrate și luați suma tuturor pătratelor și îl conectați în acest S care va intra într-un coeficient de corelație. Asemănător cu valorile și ipotezele lui Pearson, dar acum nu faceți presupuneri despre parametri, vorbiți doar despre ranguri, este un test non-parametric. Și apoi, N este numărul total și aplicați acea formulă. Acum, ei aplică această formulă la acest set de date aproximativ același sau foarte asemănător. De fapt, un set de date. O altă critică pe care au avut-o a fost că utilizarea unei măsuri mai bune a abundenței proteinelor ar fi utilizarea unui trasor radioactiv în proteină. Și apoi măsurarea cantitativă a intensității particulelor beta eliberate de metionină în proteine. Făcând acea modificare și comparând- o cu aceeași evaluare a ARN mesager , au obținut această corelație destul de liniară pe trei logari. Folosind coeficientul de corelație Pearson, pe care nu l-au aprobat în totalitate, au obținut un 0,76, ceea ce este un modest -- este o tendință liniară semnificativă. Și folosind metoda lor de rang 0,74, care este în principiu foarte asemănătoare. Și nu a găsit nicio diferență semnificativă între primele 33% și cele inferioare 33 de proteine. Subminând afirmația anterioară că a existat mai puțină liniaritate la una decât la alta. S- ar putea, sau vă așteptați, ca majoritatea cea mai puțin abundentă a proteinelor să aibă un pic de zgomot fie biologic, fie instrumental. Cu toate acestea, acest grup a constatat că este o corelație bună. Acum, aceste două complot-- complotul din următorul diapozitiv arată similar, dar este cu adevărat diferit. Aici rămâne axa Y. Abundența proteinelor este măsurată prin această etichetare F 35, dar acum ne întoarcem la acest joc de a ne întreba în ce măsură putem face predicții despre proprietățile proteinelor? În acest caz, abundența lor se bazează pe utilizarea lor de codoni abundenți. Și o modalitate de a cuantifica acest lucru este indicele de coadaptare. În partea din stânga jos a slide-ului este afișat tu -- este jurnalul indicelui de coadaptare, este o sumă a tuturor frecvențelor F din I ale fiecărui codoni. Unde I este cei 61 de codoni non-stop din totalul de 64. Și W sub I este un factor de așteptare, unde este raportul dintre frecvența codonului I. Să presupunem că un codon de leucină există șase codoni diferiți de leucină și să spunem că primul, W sub 1 va fi raportul dintre frecvența primului codon la oricare dintre ele se întâmplă să fie cel mai abundent. Ar putea fi primul, sau poate fi unul sau ceilalți șase. Și așa, aceasta este formula care este folosită. Și puteți vedea, din nou, o tendință liniară drăguță în care, într-adevăr, cele mai abundente proteine ​​tind să folosească cei mai abundenți codoni. Codonii pe care îi găsiți sunt cei mai abundenți atât la nivelul ARN-ului transponder, cât și la utilizarea în proteine ​​abundente. Acum, la fel ca și în cazul ARN-urilor, le puteți măsura pe o scară absolută sau pe o scară de raport. Avantajul în principiu dacă îl aveți la scară absolută, puteți calcula oricând rapoarte din el. Dar nu neapărat invers. Ai rapoarte la care nu poți ajunge întotdeauna la absolut. Deci acesta este un avantaj absolut. Dacă te uiți la lucruri precum indicele de adaptare a codonilor sau ARN-ul mesager, sau o varietate de alte motivații pentru tine, trebuie să o faci la scară absolută. Dar acolo se poate argumenta pentru a o face la scară ratiometrică sau relativă, în sensul că se pot stabili standarde interne mai precise. Puteți elimina cu adevărat multe dintre erorile sistematice care se pot strecura din cauza ionizării diferențiabile în cazul spectrometriei de masă și așa mai departe. Acum, cu ARN, modul în care am făcut această cuantificare a raportului de testare a raportului este să etichetăm un ARN mesager cu roșu sau cu site-ul 5, iar celălalt verde, iar apoi, folosind filtrarea selectivă în imagistica, ați putea obține rapoarte. Cu spectrometria de masă, nu ai culori. Dar într-un fel, vrei să transmiți aceeași idee și, deci, ceea ce faci este să ai mase. Deci ceea ce doriți să faceți este să le codificați în ceva care nu va schimba chimia, dar va schimba masa. Nu schimbați prea mult masa pentru că dacă schimbați prea mult, s- ar putea să schimbați chimia, sau s-ar putea să nu reușiți să găsiți vârful de umbră, al doilea vârf. Deci, practic, ceea ce facem este că vrem să facem este să luăm starea de sine 1, să o etichetăm cu un reactiv ICAT ușor , să o etichetăm cu o stare grea, adică mai mulți neutroni în ea și apoi amestecați-le cât mai curând posibil. Și apoi toți acești pași care ar putea avea mici erori sistematice vor fi erorile distribuite în mod egal la fiecare dintre dimensiunile de testare și etichetate și apoi măsurate masa. Și pentru fiecare masă, veți avea două vârfuri care sunt separate de orice diferență de masă dintre modificările de etichetare. Deci, care sunt proprietățile pe care le doriți de la un agent de etichetare? Una este că ar trebui să reacționeze covalent, astfel încât să supraviețuiască tuturor acestor pași de fracționare și pași de detectare a masei. Deci, în acest caz, trebuie să fie specific pentru dosar. Vrei o modalitate de a scoate numai acele peptide care au fost modificate. Toate restul doar vor contamina spectrometria de masă. Și între ele, vrei ceva în care să poți eticheta diferențial atomii grei sau ușori. În dovada originală a conceptului, acest lucru a fost făcut cu atomi de hidrogen versus deuteriu. Ele diferă cu o unitate de masă atomică pe poziție. Cu toate acestea, veți vedea în următorul diapozitiv, acest lucru are consecința nefericită că hidrogenul și deuteriul nu se disting doar în masă, ci au și proprietăți chimice diferite . Există un efect izotop care este detectabil într-o varietate de chimie, inclusiv timpul de retenție pe HPLC. Acesta a fost actualizat de atunci pentru că aveți C13 versus C12. Acum, aceasta este o diferență mult mai subtilă. Aceeași diferență de masă. Ai nouă atomi de carbon diferiți aici și asta funcționează mai bine. În plus, există o modalitate prin care puteți elimina părtinirea după ce și-a făcut treaba, unde l-ați adăuga și ați selectat toate acele peptide care au fost modificate și apoi acidul le-a scindat pentru a curăța specificațiile de masă. Deci iată un exemplu în care aveți diferența în M peste Z, de 4, M peste Z și este între aceste vârfuri grele și ușoare . Iar raportul dintre aceste două este ceva pe care îl puteți utiliza în esență pentru fiecare peptidă în care perechea de vârfuri se află într-o parte neaglomerată a spectrului de masă. Și iată dovezi în care puteți vedea că pe timpul de retenție și pe axa orizontală din partea stângă a Slide 41. Puteți vedea această mică linie roșie arată cum ar trebui să se alinieze centroizii setului de vârfuri și a fost deplasat prin efectele chimice ale acestuia adăugând câțiva neutroni. OK, deci lecția de aici este că hidrogenul deuteriu nu este neapărat identic din punct de vedere chimic. Pretenția izotopilor este că ar trebui să fie într-adevăr identici din punct de vedere chimic, dar într-adevăr este mai bine dacă lucrați cu atomi mai grei pentru a introduce neutroni. Acum, ce putem face cu acest acid ratiometric? Acum, vom... la fel ca înainte, am comparat nivelurile absolute de proteine cu nivelurile absolute de ARN, acum vom măsura rapoartele. Și pentru a face rapoarte, trebuie să avem două condiții diferite. Deci, un alt avantaj absolut este că puteți face totul sub o singură condiție. Aici cele două condiții care au fost alese pentru acest experiment de demonstrare a conceptului au fost glucoza și galactoza. Adică să-l crească plus sau minus galactoză. Galactoza este un sistem metabolic și de reglare bine înțeles în drojdie. Se potrivește cu ceea ce știm despre metabolismul central al carbonului și induce aici un set de gene în albastru care sunt necesare pentru ca catabolismul galactozei să producă energie. Cele mai puternice sunt departe în colțul din dreapta sus aici, Dow 710, și unul, acestea sunt enzimele catabolice de bază. Dar aproape toate triunghiurile albastre înnăscute au un fel de poveste ca asta. Și toate acestea sunt în cadranul din dreapta sus, au un raport ridicat de expresie log 10 de până la trei logari la inducția a treia ori. În mod similar, la celălalt capăt al spectrului din cadranul din stânga jos se află genele respiratorii care sunt implicate, de exemplu, în fosforilarea oxidativă. Și acestea sunt moderat deprimate în condiții de galactoză și de aceea sunt în colțul din dreapta jos. Și apoi cele verzi nu sunt chiar de-a lungul acestei diagonale. ARN-ul lor mesager este crescut, dar expresia proteinelor lor nu este. Și acestea sunt genele proteinei ribozomului și acesta este un alt fenomen care este bine documentat în sistem. BINE. Acum, acestea sunt exemple despre cum puteți utiliza absolut și relativ și de ce sunteți motivat să utilizați măsuri absolute și relative pentru proteine ​​și ARN-ul mesager. Acum, toate acestea se tratează ca și cum, la fel ca înainte, am spus că ARN-ul mesager ar putea aduna toate formele de îmbinare și s-ar putea numi asta produsul genetic. Deși știți mai bine și același lucru cu proteinele, s- ar putea să adunați toate formele de îmbinare a proteinelor. Și nu numai asta, ci pentru o anumită formă de îmbinare a proteinei, există multe modificări sintetice diferite, cum ar fi proteoliza și fosforilarea. Și așa că vom vorbi foarte pe scurt despre aceste modificări pentru a vă trezi apetitul pentru una dintre cele mai interesante părți ale proteomicei, fie că este vorba de identificare sau cuantificare. Deci am menționat deja etichetarea izotopică radială ca modalitate de cuantificare. Folosind diverși sulf radioactiv, puteți folosi, fie că este vorba de izotopi stabili sau izotopi radioactivi, îi puteți folosi pentru a face etichetarea impulsurilor pentru a monitoriza un proces dinamic. P-32 dacă, în special, dacă doriți să vă îmbogățiți pentru unele dintre cele mai bine studiate și semnificative modificări fotosintetice implicate în transducția semnalului. Vă puteți îmbogăți pentru anumite tipuri de aminoacizi. Am arătat deja că cisteinele, care este un aminoacid arbitrar ales pentru metoda ratiometrică ICAT, a fost ales pentru că are o reactivitate interesantă, nu pentru că sunt molecule de reglare cu abundență scăzută intrinsec importante . Fosfații, pe de altă parte, pot fi foarte importanți și ar putea fi necesar să vă îmbogățiți, deoarece aceste locuri importante de fosforilare reglatoare se pot pierde în zăpada tuturor celorlalte peptide din proteom. Acest lucru se poate face fie - această îmbogățire poate fi realizată fie cu metale imobilizate, cum ar fi fierul și galiul și așa mai departe. Aceasta se numește imac pentru cromatografia de afinitate cu metale imobilizate , sau puteți avea anticorpi care sunt anumite peptide fosfat specifice și anumiți aminoacizi fosfatați. Aveți lectine pentru carbohidrați ca front-end pentru spectrometria de masă. Chiar și atunci când facem etichetarea metabolică a P-32, unde P-32 va eticheta doar subsetul de proteine care sunt fosforilate. Este încă cazul că unele dintre cele mai interesante proteine regulatoare ale ciclului celular nu sunt detectate deasupra fundalului, deoarece există multe proteine ​​​​abundente, cum ar fi proteinele ribozomilor, enzimele metabolice centrale ale carbonului, care sunt necesare în mare abundență, dar trebuie să aibă și fosforilare. . Și astfel obțineți această pădure de proteine ​​​​fosfat, cum ar fi ribozomi și metabolice, care îngreunează detectarea celor reglatoare. Deci etichetarea nu este un panaceu și vom veni... Cred că veți vedea pe măsură ce trecem prin modificările proteinelor și prin spectrometria de masă, este o purificare multidimensională, într-adevăr, este modul în care scapi de proteinele ribozomale și de proteine ​​metabolice abundente, care sunt interesante, dar aveți nevoie de o modalitate atât de a le stabili, cât și de proteine ​​de nivel scăzut de reglementare. Iată câteva exemple de procese naturale. Deci vă puteți gândi la aceasta ca la o clasă specială de modificare post-sintetică. În loc să ai un fosfat glomming, aveți două peptide diferite fie intramolecular în cadrul unei proteine, fie intermolecular între proteine. Și ar trebui să fii foarte motivat să le studiezi pentru că îți spun ceva nu numai despre structura proteinelor, structura tridimensională, care a fost subiectul ultima dată, ci și despre interacțiunile proteină-proteină. Și nu doar teoretic, ce proteine ar putea interacționa cu alte proteine, sau s-ar putea lega in vitro ar putea fi artefact in vitro sau în sistem drojdie la hibrid, ar putea fi un artefact drojdie la hibrid. Acestea sunt interacțiuni covalente reale prinse în actul proteinelor in vivo . Și unele dintre acestea sunt-- cele mai multe dintre acestea sunt foarte bine documentate. De departe cea mai comună și de mare importanță pentru stabilitatea terțiară a proteinelor din clasa proteinelor, care sunt extracelulare. Acestea includ domenii extracelulare ale proteinelor membranare și ale proteinelor secretate și, în special, pentru că acolo starea de oxidare este astfel încât această legătură de sulf sulf este stabilă, în timp ce intracelulară tinde să fie mai reducătoare a atmosferei și astfel încât aceste disulfuri au probleme de formare. Colagenul are o legătură încrucișată cu lizină. Ubiquitina are o legătură încrucișată la capătul C-terminal la lizină. Fibrina implicată în coagularea sângelui are glutamina glicină și așa mai departe. Pe măsură ce unele dintre proteinele dumneavoastră îmbătrânesc, veți găsi glucoza în concentrații mari din sângele dumneavoastră va glicola reziduurile de lizină. Și aceasta face parte din procesul prin care aceste proteine ​​își pierd în cele din urmă funcția și sunt curățate. Interacțiunile proteinelor acid nucleic despre care am vorbit până acum sunt non-covalente. Unele dintre ele sunt covalente, de exemplu, atunci când doriți să activați sinteza polimerului de Novo , sinteza ADN. OK, deci care sunt consecințele pentru algoritmii de spec. de masă despre care am vorbit, să zicem, secvențierea de Novo sau găsirea unui spectru de peptide în baza ta de date? Ei bine, puteți vedea că masele vor fi destul de simple. Iată câteva exemple de unele mase, de unele peptide și de unele peptide de reticulare. În dreapta sus, veți vedea un intermolecular reticulat între o lizină și o lizină și un intermolecular între două peptide. Acum, fiecare dintre aceste peptide din acest afișaj, acestea sunt doar mase simple. Acestea nu sunt fragmente. Acestea nu sunt niște fragmente. Așa că vă așteptați ca acestea să fie produse triptice. Deci, fiecare dintre terminalele lor C ar trebui să fie fie arginină R, fie lizină K. R, K, K, R și așa mai departe, și astfel puteți vedea că acestea sunt două peptide, una care se termină în R, una care se termină în K. Deci, să ne uităm la detalii la acest exemplu în care aveți o legătură încrucișată intramoleculară. Și puteți vedea că, pe măsură ce o scindați, fiecare dintre aceste legături peptidice intră în ionii B de la capătul N-terminal și ionii Y de la capătul C-terminal. Veți vedea că există un caz special în regiunea care este definită între cele două legături încrucișate și că orice scindare a legăturii peptidice care ar putea avea loc în faza gazoasă atunci când se ciocnește cu argonul sau cu alt gaz inert va rupe lanțul ca de obicei. Dar lanțul nu se va destrama pentru că are de fapt două conexiuni. Unul este prin legătura peptidică normală. Și celălalt este prin cross-link. Deci decolteul este complet aici. Este nevoie de două lovituri pentru a obține separarea acestora, iar două lovituri este puțin probabil. Și astfel, vei avea tendința de a vedea ionii B în ionii Y chiar până când vei lovi primul aminoacid reticulat și apoi îl pierzi. Deci, aceasta este una dintre complicațiile pe care le aveți de la legăturile încrucișate. Celălalt, atunci când aveți, să zicem, reticulare a două peptide, ar putea să apară atunci când aveți o interacțiune între diferite proteine, este că acum veți avea două seturi de ioni B și două seturi de ioni Y. Deoarece dacă doar ai B și Y în același spectru nu este suficient, acum ai două din fiecare și, deși nu ai ciclul de care să-ți faci griji, ai un set complet. Dar există un algoritm pe care Tim Shen și alții l- au dezvoltat pentru a se ocupa de asta în cazuri foarte curate. Și iată un exemplu de utilizare reală a legăturilor încrucișate pe care le obțineți din spectrometria de masă ca un set destul de ieftin de constrângeri pe care le puteți utiliza pentru obținerea distanțelor fie intramolecular în acest caz, fie intermolecular. Și constrângerile. Nu poți deveni mai mare decât distanța reticulat. Știți că structura chimică a reticulantului și, deci, puteți spune că acești doi aminoacizi cu lanțurile lor laterale și așa mai departe reacționează trebuie să fie această verigă sau mai scurtă. Și asta indică aceste mici linii galbene în acest factor de creștere a fibroblastului doi, FGF doi, unde este cunoscută structura cristalină a FGF doi. Și aceste constrângeri vă vor ajuta foarte mult capacitatea de a găsi omologi la distanță sau de a crește precizia modelării dvs. de omologie în trei dimensiuni. Cu cât interconectați mai scurt, evident, cu atât mai bine, cu atât constrângerile dvs. sunt mai strânse, dar ar putea reduce eficiența legăturilor încrucișate. Dacă faci asta ca reticulare artificială, spre deosebire de dacă ai o reticulare naturală, practic ești blocat cu orice este natural. Aceasta a fost o reticulare artificială cu un agent de reticulare chimic sau cinci reticulanti funcționali. Acesta este doar un memento. Acesta este un mod diferit de a arăta unele lucruri. Ultima clasă am avut o diagramă de dispersie, care a arătat că, pe măsură ce creșteți identitatea secvenței în modelarea omologiei până la 100% pe axa verticală, vă scădeți incertitudinea și deviația pătratică medie observată pe care o obțineți între două structuri. Dar sunt mai bune decât 80%. Apoi aveți de ordinul unei abateri Angstrom, ceea ce este destul de acceptabil pentru multe scopuri. Acum, dacă vrei să faci threading către structuri foarte îndepărtate, scăderea în jur de 30% înseamnă să ajungi la 25% este să obții Twilight Zone, unde chiar nu-ți vine să crezi. Este oprit de prea multe angstroms. Dar aceste constrângeri din diapozitivul anterior te-ar putea ajuta fie să faci modelarea mozzie, fie să faci un threading în care cauți printr-o secvență preferată printr-o bază de date de structuri tridimensionale pentru a întreba de ce structură tridimensională este cea mai apropiată. Acum că FGF doi, am avut două diapozitive înapoi cu toate aceste constrângeri care pot fi rulate prin algoritmul de threading, unde rulați secvența prin baza de date ilustrată aici până la această orizontală, apoi către diferitele rânduri ale diferitelor structuri de aici. Familia pliuri este în a doua coloană din stânga. Identitatea secvenței secvenței noastre de căutare, care este FGF doi, față de toate aceste structuri tridimensionale care prezintă identitatea aici 98.6 este, în principiu, aceeași structură. Acesta este exemplul banal, deoarece rangul firelor este numărul unu, așa cum ar trebui să fie, deoarece este exact aceeași structură - aproape exact aceeași structură. Zona de constrângere, desigur, va fi zero, deoarece toate structurile tridimensionale și toate legăturile încrucișate funcționează la acea structură. Dar unul interesant acum, acesta a fost clasat după eroarea de constrângere, nu după rangul de threading. Și așa că vă puteți întreba dacă acest lucru îmbunătățește hiturile? Iar următorul în jos este FGF doi în comparație cu datele culoarului unu și au aceeași familie de ori. Știm asta din structura tridimensională, iar identitatea procentuală este mult sub limita obișnuită, unde nu puteți deduce din threading sau secvențiere. De fapt, rangul de filetare este cinci. Nu este al doilea cel mai bun thread. Dar este o săgeată dreaptă zero și, prin urmare, dacă combinați rangul bun de threading în eroarea de constrângere, atunci ați pune acest lucru ca fiind cel mai bun omolog, doar 12% până la 13% identitate de secvență. Și, desigur, depășește ranguri de threading mai bune, deoarece are mai puține erori de constrângere. Deci, puteți vedea cât de puternice ar putea fi aceste constrângeri și, cu siguranță, trebuie doar să evaluați cât de rentabilă este spectrometria de masă. Acum, ultimul subiect de astăzi, în domeniul modificărilor și interacțiunilor proteinelor, este modul în care cantitam metaboliții. Acum puteți vedea că avem un impuls aici în ceea ce privește proteinele cantitative din ARN. Și care sunt problemele care sunt ușor diferite de metaboliți? Și Slide 52 rezumă câteva dintre acestea. Aveți când deschideți o celulă pentru a izola ARN mesager sau proteine. Există rata la care acționează enzimele degradative este de ordinul secundelor. Acesta este ritmul cu care merg, în timp ce multe dintre alte procese metabolice durează de ordinul milisecundelor până la microsecunde. Cinetică foarte rapidă și, pe măsură ce celula începe să se îmbolnăvească puțin pe al doilea interval, toate aceste enzime amestecă concentrațiile metaboliților. Deci ai aceste schimbări rapide. Metodele de detectare sunt idiosincratice din punct de vedere istoric. Ele pot fi legate de enzime, acolo unde veți avea pentru a detecta metabolitul, aveți o serie de enzime care au ca rezultat un test fluorescent sau luminiscent . Sau ar putea fi cromatografia gazoasă, cromatografia lichidă, spectrometrul de masă RMN și așa mai departe. Vestea bună este că de obicei există mai puțini metaboliți decât ARN și proteine. Ar putea fi 30.000, unele ARN-uri și proteine, de obicei, doar 1.000 de metaboliți, chiar și în cei mai exotici, activați metabolic, cum ar fi E Coli. Aici, din diferitele lor baze de date, ecosite, lățime, etichetă și așa mai departe, care integrează informații despre metaboliți cu enzimele pentru a acționa asupra lor. Aici, ne uităm doar la gama de masă pe care o avem. Gama de masă tipică, acestea sunt foarte mici în comparație cu proteinele din ARN. Cele mai multe dintre ele fiind în jur de 200 de unități de masă atomică. Și multe dintre ele având o masă absolut identică, adică au atom pe atom exact aceeași compoziție, deși este dispusă în trei dimensiuni foarte diferit. De exemplu, izoleucina și leucina, așa cum ar putea sugera și numele lor, au exact aceeași masă, indiferent de câte cifre semnificative le-ați pune. Și acest lucru este ilustrat de datele reale despre izoleucină și leucină. Aceste versiuni presupus foarte purificate disponibile comercial de izoleucină și leucină s-au amestecat aici și se epuizează în aceste două dimensiuni de masă și axa orizontală și timp de retenție și separare hidrofobă. Acum, nu peptide, ci aminoacizi, metaboliți, și puteți vedea cum că, deși sunt identici ca masă, așa cum se arată în diapozitivul anterior, în jurul valorii de 131, sunt separabili prin hidrofobicitatea lor. Au aceeași compoziție atomică, dar sunt separabile doar prin această separare hidrofobă. Și puteți vedea în presa comercială, există o varietate de molecule contaminante care co-migrează în dimensiunea lor de fază inversă, probabil pentru că ceva de genul fazei inverse este folosit pentru purificarea lor comercial. Deci, există trei moduri de a distinge moleculele care au aceeași masă. Cel din slide-ul anterior le separa printr-o altă proprietate, cum ar fi timpul de retenție asupra proprietăților hidrofobe. Un altul este fragmentarea secundară. Așa cum am putea fragmenta peptidele prin ciocnirea în faza gazoasă cu niște gaz inert, putem face acest lucru cu metaboliți. Și astfel, două lucruri care au aceeași masă pot avea un model de fragmentare diferit. Și puteți vedea din nou, o puteți desprinde în fiecare poziție particulară și aici sunt două aspecte diferite și două laboratoare diferite. Metodologie ușor diferită care arată fragmentarea în aproape fiecare legătură de carbon. A treia metodă prin care puteți distinge compuși care au exact aceeași masă, iar acest caz este cel mai extrem. Acești compuși au aceeași masă. De fapt, nu numai că au aceeași compoziție chimică, aceeași compoziție atomică, ci au de fapt aceeași structură chimică. Cele trei dimensiuni ale lor sunt aceleași. Masa lor este aceeași. Ce este aceasta - să spunem că roșul este carbon-13, iar verdele este carbon-12. Puteți avea carbonul-13 în diferite poziții pe această, de exemplu, această moleculă de glucoză. Deci are aceeași structură cu patru dimensiuni, aceeași masă. Doar că ai mutat poziția C-13 în diferite poziții. Acesta este de fapt un caz interesant când aveți glucoză din abundență naturală, unde aveți urme de C-13 , aceasta poate fi poziționată pe diferiți atomi de carbon. Dar încă poți să-ți dai seama unde este, până când... acum nu este defalcat în faza gazoasă, cum ar fi disocierea indusă de coliziune . Dar e stricat în celulă. Trece prin diferite căi. Și acesta este exemplul... că vom vorbi despre căi non-stop pentru următoarele trei sesiuni. Dar iată un exemplu de metabolism central al carbonului, în care începeți cu glucoză și glucoză fosfat în colțul din stânga sus al acestei diagrame de rețea și ajungeți cu dioxid de carbon în jos, în stânga jos. Și poate trece prin diferite căi prin ribuloză sau în jos prin trei atomi de carbon. Și fiecare dintre acești trei și doi produse de descompunere a carbonului poate avea atomul etichetat, atomul etichetat cu masă în poziții diferite. Și, deoarece acest citat din literatură subliniază că atunci când doriți să studiați fluxurile prin intermediul căii, prin monitorizare, puteți face de fapt un impuls sau o etichetare stabilă în stare de echilibru cu etichete izotopice. Și puteți monitoriza fluxurile prin aceste căi. Dar trebuie să țineți cont de toate căile diferite prin care puteți parcurge căile. Mai ales, când faci cicluri metabolice precum ciclul TCA sau trebuie să te gândești la toate turele multiple. Acum, în principiu, acest tip de urmărire metabolică se poate face fie cu spectrometrie de masă, fie cu rezonanță magnetică nucleară. Când faci rezonanță magnetică nucleară 2D cantitativă, te uiți practic la schimbările cantităților spectrale pentru carbon-13. Amintiți-vă, vorbeam despre etichetarea carbonului 13 și despre protonii normali, cei mai abundenți. Schimbările chimice pe care le obțineți aici se datorează mediului chimic exact al acestui proton sau carbon-13 pentru, de exemplu, alfa pentru fiecare dintre acești aminoacizi, alfa beta. Și fiecare dintre aceste mici grupuri sunt schematice pentru intensitatea acestor atomi particulari pe care îi monitorizați prin efectele lor izotopice asupra RMN-ului aici. Numărul impar de nucleoni este critic pentru detecție. Bine, deci dacă cunoașteți structura rețelei, atunci puteți folosi aceste cunoștințe și știți care dintre acești atomi intră în ce părți, atunci puteți folosi acest lucru pentru a cuantifica fluxurile prin orice punct al rețelei. Pe de altă parte, dacă cunoașteți doar o parte a rețelei, atunci puteți utiliza acest mod ca o urmărire pentru a pune lent împreună cum trebuie să meargă rețeaua. Cele mai multe dintre acestea au fost rezolvate cu mult înainte de genomica și sistemele noastre actuale, metodele de biologie și, prin urmare, nu există algoritmi reali pentru a face acest lucru din câte știu eu. Deși, cu siguranță, există o oportunitate de a o face. Acum, asta măsoară... amintiți-vă aceste rapoarte față de sumele absolute. Aceasta măsoară nu numai rapoartele concentrațiilor metaboliților. Acestea nu sunt concentrații de metaboliți, ci fluxuri. Deci, cu metaboliți, puteți măsura concentrații sau fluxuri absolute sau rapoarte. Toate cele patru combinații. Acum, să spunem... din nou, în principiu, dacă puteți măsura concentrațiile absolute, puteți măsura rapoarte și puteți măsura rapoartele fluxurilor. Deci, cum vei măsura concentrația absolută? Deci, amintiți-vă, am spus că una dintre probleme a fost că de îndată ce începeți să perturbați celula în microsecunde, puteți obține modificări. Dar o modalitate de a face acest lucru este să nu tăiați celulele. Puteți să le înghețați mai întâi. Da, expuneți-le rapid la metanol apos la -40. Le poți spăla așa, este un lichid și poți elimina metaboliții din exterior. Și există motive să credem că aceasta este metoda minim perturbatoare de preparare a celulelor. Și apoi le pui practic în alcool clocotit și apoi cuantificați cu metode RMN precum cele despre care tocmai am vorbit, obținând până la 1.300 de măsuri per probă. Câteva exemple ale unora dintre aceste concentrații interne de metaboliți , acum, amintiți-vă, acestea nu sunt rapoarte de flux. Dar concentrațiile reale de metaboliți ai unor lucruri precum glucoză fosfat, ATP, piruvat și așa mai departe, pot fi corelate cu genomica prin vehiculul knockout-urilor genelor. Avem tipul sălbatic în partea de sus a extremei stângi, urmat de o ștergere a lui HO. Aceasta este o orientare în nucleu, nu ar trebui să aibă deloc consecințe metabolice. Acesta este folosit ca control. Este un tip pseudo sălbatic , arată doar că metoda de ștergere în sine nu schimbă lucrurile, metabolismul. Și apoi, pe măsură ce mergi din ce în ce mai departe în această listă, obții efecte așteptate din ce în ce mai severe asupra capacității organismului, să zicem de a produce energie, așa cum este exemplificat prin producția sa de ATP. Acum, dacă aveți o producție scăzută de ATP, înseamnă că aveți niveluri reziduale ridicate de ATP, care este celălalt capăt al spectrului energetic. Și așa că, dacă te uiți în jos aceste coloane, este puțin greu de văzut cu toată dezordinea produsă de abaterile standard. Nu aș vrea să scape de acele abateri standard. Este minunat, dar oricum, puteți rezuma acest lucru uitându-vă la raportul ATP la ADP. Acesta este un mod în care nu aveți nevoie de rapoarte pentru ca acest lucru să funcționeze. Dar este o modalitate de a accentua acest echilibru energetic și, astfel, puteți vedea, pentru un tip sălbatic, aveți aproximativ 7 este raportul dintre ATP și ADP. Foarte încărcat în această stare de înaltă energie. Și pe măsură ce ajungi la acești mutanți de companie, care sunt mutații în procesul mitocondrial, descoperi că celula devine din ce în ce mai ineficientă. Acum, toate acestea au fost alese pentru că acestea erau așa-numitele mutații tăcute. Titlul acestei lucrări spune că puteți obține fenotip uitându-vă la analiza moleculară cuantificând întregul holistic, sistematic toți metaboliții pentru lucruri care altfel nu au fenotipuri. BINE. Acum, această reprezentare... pe măsură ce începi să cuantificați proteomica integrală, interacțiunile proteomului, modificările proteomului, metaboliții în interacțiunile lor, începeți să doriți să transmiteți aceste informații. Rezumați aceste informații în contextul modelelor. Și la fel ca data trecută, în partea din stânga sus a acestui rezumat, subliniez că niciun model nu este exact. Uneori, oamenii care lucrează în domeniu se convin că este mai exact decât modelele inferioare. Dar fiecare dintre acestea, chiar și mecanica cuantică, este o aproximare slabă a electrodinamicii, iar mecanica moleculară are reprezentați doar atomi sferici. Unele dintre cele mai provocatoare modele celulare implică ecuații masive de stocastică. Acum, nu mai vorbim de atomi unici. Vorbim despre molecule individuale. Totuși, este prea grosier pentru multe experimente. Puteți avea rate fenomenologice, precum cele despre care am vorbit, reprezentate în ecuații diferențiabile obișnuite. Cum obțineți parametrii care descriu acum concentrația și timpul? Nu molecule individuale, ci tratarea lor ca o pungă dintr-o anumită parte a celulei sau ca întreaga celulă având o anumită concentrație de molecule. Și apoi vom continua pe măsură ce intrăm în analiza rețelei, iar în următoarele câteva prelegeri, vom vorbi despre câteva dintre aceste alte modele, care au rolurile lor. Dar să ajungem la... cum am obține unii dintre parametrii care descriu concentrația în timp? Și când vorbim despre formalismul acestor rețele, rețelele de reglementare, în principal sunt legate de obligații. Dar se conectează strâns cu rețelele catalitice, unde nu numai că te leagă, dar și schimbi de fapt structura covalentă a moleculelor. În cel mai simplu astfel de caz, un singur substrat care iese într-un singur produs este că partea de sus a acestui Slide numărul 60. Și aici, puteți vedea că enzima E, care este de obicei o proteină și/sau, dar există catalizatori ARN și așadar. pe. Dar proprietatea care este subliniată aici este că enzima nu este consumată. Pe măsură ce A intră, face o schimbare covalentă de la EA la EB, B este eliberat. E este reciclat. E nu este consumat de ciclu, dar A este consumat. B este produs. Dar să ne uităm la asta într-o altă lumină. Într-o clasă deosebit de interesantă de reacții, de exemplu, cele care implică modificări ale enzimei de transducție a semnalului în cascadă reglatoare. Aici enzima devine acum substrat. ATP-ul nu mai este consumat acum pe tot ciclul. ATP intră, modifică enzima într-o enzimă fosfat. Și reacția însoțitoare regenerează... transformă ATP-ul înapoi în ATP. Deci, ATP, într-un anumit sens, este catalitic aici, iar acum enzima este consumată, producând o enzimă fosilă. Deci totul depinde de când ați început să construiți aceste grafice. Care este nodul - în interiorul nodului este un substrat, iar nodul este o enzimă, depinde de cum îl priviți? Și fac asta oarecum provocator, așa că te vei gândi la aceste rețele nu doar ca obligatorii, ci ca cataliză. Și nu doar enzima fiind catalizatorul, ci uneori și substratul. Acum, acesta este cel mai simplu caz de măsurare a cineticii. Acesta nu este echilibru. Aceasta este cinetica. Și studiem această diagramă în partea stângă a Diapozitivului 61. Pe măsură ce substratul crește, rata de producție a produsului crește. Ați putea începe cu zero produs sau cantități mici și, din punct de vedere istoric, era în partea de jos, ați avea nevoie să faceți experimentul, ați cere ca produsul să fie cât mai aproape de zero posibil. Ai face ratele inițiale și ai această relație simplă în care creșterea produsului a fost o funcție simplă a 1 peste 1 plus reciproca concentrației substratului. Și pe măsură ce substratul ar crește, în cele din urmă veți satura cantitatea de enzimă pe care o aveți prezentă în experiment și aceasta ar fi viteza maximă pentru acea cantitate de enzimă ar fi max. Cu toate acestea, dacă aveți o ecuație mai completă în care luați în considerare toți jucătorii, cel puțin în cel mai simplu sistem, viteza înainte, PDT derivata concentrației produsului ca subiect al timpului, aceasta ar putea fi în mol/L per litru. Va crește pe măsură ce un substrat va crește. Mai mult substrat înseamnă că va merge mai repede în direcția înainte către produs. Dar dacă aveți un produs, veți avea o anumită inhibiție a produsului. Veți avea tendința de a merge cinetica în direcția opusă. Deci, acest lucru este negativ - există o componentă negativă cu produsele. KS și KP sunt uneori numite constante Nikolaus pe măsură ce substratul se apropie de constanta Nikolaus. Acest lucru este în principal legat de afinitatea de legare pentru substrat. Și acesta este un punct intermediar natural în care substratul este pe jumătate saturat este aproximativ ceea ce înseamnă KS. Acum să comparăm acest caz foarte simplu. Avem un substrat care produce un produs într-un caz mai tipic în care este posibil să aveți două substraturi care produc două produse. Și să scoatem asta dintr-o rețea reală. O să arătăm această rețea reală într-un moment și totul este nămol. Aici aveți două substraturi ATP și F16 care merg la 2 produse ATP și FTP. Și aveți aceeași formă în care aveți o viteză a acestei reacții. Și este o funcție a reactanților F16 și ATP și îi găsiți la numărător aici. Și găsești aceste constante Nikolaus în locurile potrivite. Dar in plus, gasesti in numitor acest termen curios, are aceste a patra puteri. Ei bine, nu am văzut nicio a patra putere în slide-ul anterior. De ce obținem a patra putere doar pentru că și de ce este AMP aici? Nu este nici măcar una dintre reacții sau produse. Ce se întâmplă? Ei bine, acesta este de fapt un fenomen regulator alosteric în care aveți un al doilea loc pe enzimă. Un site face magia catalitică, iar celălalt este reglementat de unii în înțelepciunea infinită a întregii rețele, adică feedback important. Deci, AMP este legat de ATP ca un pas suplimentar și se alimentează cu această enzimă, la fel ca F16 și ADP și așa mai departe. Deci toate astea... și această a patra putere spune doar că vrei să fie cooperant. Vrei să ai o reglementare neliniară. Asta se întâmplă în acest mandat. Și nu apare în întreaga rețea, o vom arăta în următorul diapozitiv. Dar apare în unele puncte cheie, cum ar fi acesta, unde enzima are două situsuri, catalitic și de reglare. Și când vedeți acești termeni care sunt mai mari decât liniari, cum ar fi puterea a patra, uneori se referă la coeficientul Hill și se referă la abruptul de-- în loc să aveți acest tip de curbă, aveți acest tip de curbă sigmoidă. Și apogeul semnelor este legat de acea putere. Acum, să ne uităm... dacă comparați... deci această mică parte, această etapă a fosfofructokinazei, va fi pusă în contextul întregii rețele din celulele roșii din sânge, globulele roșii umane chiar aici, în cadranul din stânga sus al globului. cerc. Și aceasta este cea mai simplă analiză - aceasta este cea mai simplă rețea metabolică despre care veți vorbi. Aceasta implică în principal tranziții covalente sau pompare prin membrane. Tratează întreaga celulă ca o pungă uniformă, o membrană fiind un compartiment separat. Și există într-adevăr două obiective ale acestui lucru. Una este producerea de ATP. Astfel încât să puteți rula pompele pentru a menține presiunea osmotică constantă peste membrana celulelor roșii din sânge , astfel încât să își mențină forma. Și celălalt este să mențină redox-ul la nivelul potrivit, ca și cum... astfel încât să ai o atmosferă reducătoare. Hemoglobina are un contact intim cu oxigenul, astfel încât există un anumit nivel scăzut de oxidare a fierului, mai degrabă decât să se lege doar de fier pentru a face hemoglobină, care nu este o stare fiziologică bună. Deci, doriți să aveți acest potențial de reducere pentru a-l aduce înapoi la starea corectă de oxidare, astfel încât să lege oxigenul. Deci aveți puțin metabolismul purinelor aici. Destul de glicoliză simplă, nu fosforilare oxidativă. Doar pentru că glicoliza a produs un potențial de reducere și puțin ATP, iar aceste aproximativ 40 de reacții enzimatice pot fi modelate cu aproximativ 200 de parametri. Toți acești 200 de parametri au fost măsurați cu precizie prin purificarea fiecărui metaboliți și enzime. Și acest lucru a fost redus la un model obișnuit de ecuații diferențiabile care a evoluat încă din anii '70. Dacă ne uităm la Slide 64 că această fosfofructokinază, avem aceeași formă în care am avut câteva diapozitive înapoi. Iată al patrulea termen de putere și numitorul având AMP ca moleculă de reglare. Și apoi aveți constantele Nikolous și așa mai departe, menționate în mod explicit aici în numărătorul pentru substraturile F16 și ATP. Și aveți o ecuație similară pentru fiecare pas de enzimă din întreaga rețea din modelul de celule roșii din sânge. Și în verde sunt concentrațiile, la un moment dat, care va fi starea lor dinamică sau de echilibru. La orice moment dat , veți avea verde pentru concentrațiile metabolice și roșu pentru fluxurile indicate de enzimă. Și puteți rula acest lucru ca o simulare pentru celulele roșii din sânge și puteți vedea toate întrebările interesante despre robustețe și optimitate și așa mai departe. Chiar dacă acesta este un model foarte matur, mai sunt multe de făcut, chiar și în acest sistem foarte simplu. Acum, vom trece la sisteme mai complicate în următoarele trei prelegeri despre rețele. Dar pentru astăzi, practic, am încercat să integrăm proteina, fie absolută, fie proporțională, cu măsurători de ARN și cu interacțiuni cu metaboliți, modificări post-sintetice ale proteinelor . Așa că până data viitoare, mulțumesc foarte mult.