Următorul conținut este furnizat de MIT OpenCourseWare sub o licență Creative Commons. Informații suplimentare despre licența noastră și despre MIT OpenCourseWare în general sunt disponibile la ocw.mit.edu. GEORGE CHURCH: OK. Ei bine, chiar dacă am făcut aluzii la rețele destul de mult pe tot parcursul cursului, acestea sunt cele trei prelegeri în care de fapt le luăm. Am început cu adevărat acest lucru la sfârșitul prelegerii de săptămâna trecută, așa-numita proteină 2. În cazul în care în procesul de a vorbi despre modificările proteinelor și cuantificarea metaboliților și interacțiunile acestora cu proteinele, am început să vorbim despre tipurile de surse de date pe care le-ați avea care v- ar permite să ajungeți la o analiză cantitativă a rețelelor de proteine, cum ar fi celulele roșii din sânge. Așa că vom aborda această temă vorbind despre gradienții de concentrație continui macroscopici și apoi o vom contrasta cu numerele moleculare mezoscopice sau discrete. Vom aborda pe scurt problemele legate de discriminarea dintre modelarea stocastică și modelarea continuă. Și este o conexiune foarte interesantă între modelul de celule roșii din sânge, în care aveți câteva exemple de cooperare cu coeficienți Hill modesti -- pentru a duce asta la un caz extrem în care aveți de fapt bistabilitate, în care aveți două moduri stabile care sunt separate de o interacțiune foarte cooperantă. Și apoi vom vorbi despre controalele numărului de copiere, o altă oportunitate de a face modelare fie prin modelare macroscopică continuă, fie prin această modelare stocastică. Și apoi, după pauză, vom vorbi despre optimizarea echilibrului fluxului , care cred că este o modalitate foarte interesantă și inteligentă de a valorifica micile informații pe care le aveți despre rețelele de reglementare foarte complicate, rețelele biochimice. Așa că cred că abia am mai atins asta înainte. Rețelele particulare care sunt studiate, cum au ajuns să fie studiate? De ce și cum? Și, de obicei, ceea ce au în comun este că au seturi mari de date cinetice genetice și biochimice pentru a merge cu ele - și/sau. În prezent, nu există un model care să descrie toate aspectele interesante ale unei celule întregi sau ale unui întreg organism. De obicei, există bucăți mici din el. Cel mai apropiat de o celulă întreagă este celulele roșii din sânge. Și asta pentru că nu există componente biopolimerice , nici sinteza de biopolimeri. Astăzi, vom vorbi puțin mai mult despre aceste două subiecte conexe, care este ciclul diviziunii celulare și segregarea cromozomilor în timpul diviziunii celulare. Aici, punctul cheie este natura critică a moleculelor individuale din acestea care intră în joc în celulele care se divizează. Și în asta, vor vorbi despre bistabilitate, despre cum există o decizie de a face sau nu următorul pas în divizarea celulei. Și cum acea bistabilitate poate fi obținută fie din punct de vedere stocastic, în cazul în care aveți de-a face cu fluctuațiile moleculelor individuale care afectează foarte mult un comutator, cum ar fi un comutator lambda de fază, fie o puteți avea implicând un număr mare de molecule, în care stocascul pare să joace un rol mai mic. Și apoi, la sfârșit, vom vorbi despre cum putem face un metabolism comparativ, în care integrăm literalmente genomica cu un model de rețea de biochimie la multe niveluri diferite. Desigur, există genomul care codifică componentele acelei rețele. Dar există și eliminările sistematice ale genelor și efectele lor asupra rețelei. Acum, acest diapozitiv este și o revizuire. Dar pune în context în care vom începe în principal să vorbim astăzi. Vom vorbi puțin despre ecuațiile diferențiale obișnuite, atât pentru -- la început, sub hematii, cât și în discuția despre bistabilitate, cum poți obține, chiar și doar cu concentrare și timp, poți obține aceste comportamente foarte interesante. , foarte cooperant. Și apoi vom scădea concentrația și timpul printr-o aproximare la starea de echilibru când vorbim despre echilibrul fluxului în a doua jumătate. Și bineînțeles, înainte, vorbeam despre mecanica moleculară în contextul structurii proteinelor. Iar ecuațiile masterului sunt modul de a privi moleculele singulare stocastice, pe care le vom menționa în treacăt. În cele din urmă, în rețea, discuțiile vor ajunge la modele neomogene din punct de vedere spațial, unde de fapt vă pasă sau vă dați seama de importanța locului în care se află anumite molecule în ceea ce privește funcția lor. Acum, care sunt limitele și problemele în conectarea parametrilor in vitro care au fost atât de cheie data trecută și de data aceasta în dezvoltarea unui model de sistem? Izolând anumite molecule, puteți tăia, simplifica sistemul. Dar mai e problema reintegrării. Și aici, acesta este mai mult un artefact istoric decât cu adevărat critic pentru această discuție. Și inițial, cinetica enzimatică ar ignora produsele din motive tehnice matematice. Dar după cum puteți vedea de data trecută, am arătat că puteți reprezenta acele ecuații destul de bine și chiar puteți face măsurători. În prezența produselor, ar mai fi doar câțiva termeni în ecuațiile ratei. Cu toate acestea, mai critic este faptul că includerea produsului împreună cu substratul în măsurători și modelare este doar primul pas, deoarece câte produse și substraturi diferite și alte molecule de reglementare ar putea fi implicate despre care nu știți inițial? În plus, în condițiile pentru a face măsurătorile in vitro, este greu să le faci la concentrațiile din celule. Și în celule, ele au densități aproape cristaline, așa cum spun, până la 30% sau cam așa ceva, care este practic concentrația foarte mare de substanță dizolvată care apare - proteine ​​și alte macromolecule. Iar substraturile, moleculele mici, sunt de obicei în exces mare în reacțiile in vitro. Dar sunt foarte aproape de molar egal in vivo, deoarece multe dintre ele sunt legate de enzime. Și obțineți observații interesante, cum ar fi cea menționată mai jos, unde o reacție chimică, care este spontană în soluție, care este epimerizarea galactozei, nu are loc în celulele normale ale E. coli decât dacă au o enzimă care catalizează acest lucru. reacție în mod normal spontană. Deci acest lucru este curios că se întâmplă în soluție. Nu se întâmplă în celulă decât dacă aveți enzima. BINE. Deci, având în vedere toate aceste avertismente și recunoscând că, deși acest model are mai mulți parametri măsurați decât aproape orice alt model celular, toți au fost măsurați in vitro, cu avertismentele pe care tocmai le-am menționat. Și celula are ca scop: funcția tuturor acestor rețele este în principal de a furniza redox-ul care menține hemoglobina redusă și ATP-ul care ține presiunea osmotică sub control. Și, de asemenea, celula este-- chiar dacă am arătat o mică structură în această rețea, se presupune că structura este destul de continuă în interiorul celulei, ceea ce este o aproximare destul de bună în acest caz. Deci, aceasta nu este doar capsarea unor parametri cinetici in vitro. Avem alte considerații într-o celulă reală. Avem genul de parametri fizici ai echilibrului de masă, a balanței energetice și a echilibrului redox. Am menționat deja energie și redox. Dar trebuie să aveți conservarea masei, așa cum vom vedea că se dezvoltă destul de mult în a doua jumătate a acestei discuții. În plus, există fizică, cum ar fi presiunea osmotică și neutralitatea electronilor. Există celule care au tranziție de neutralitate non-electrod. Dar pentru celulele roșii din sânge, cu siguranță, unul dintre obiective este menținerea foarte aproape de neutralitatea electronică și stabilă osmotic. Vrei să ai cât mai multe constrângeri nereglabile . Ca și în alte sisteme de modelare, dacă acestea sunt măsurători, mai degrabă decât parametrii modelului ajustabili, atunci vă permite să testați puținele ipoteze pe care le aveți și să le aveți supradeterminate și să căutați contradicții, valori aberante. Și apoi, în cele din urmă, vom vedea avantajele de a ști care sunt fluxurile maxime - ratele maxime pe care le puteți avea în aceste rețele complexe. Și am putea încorpora reglementarea genetică, deoarece am văzut că devin disponibile o mulțime de date cu ridicata, din ce în ce mai precise despre reglarea genelor . Ar fi bine să le integrăm, deoarece expresia proteinelor le afectează activitatea. Activitatea afectează aceste fluxuri. Deci, aceste fluxuri sunt reprezentate aici în diapozitivul numărul 8 ca dx dt, unde fiecare dintre subi-urile x reprezintă unul dintre aceste puncte albastre, un nod în rețea, unde aveți patru procese de bază care îl afectează - până la patru. Puteți avea pași de sinteză, pași de degradare. Deci sinteza produce transport, îl poate aduce în celulă. Degradarea îl îndepărtează. Și poate fi utilizat, încorporat în corpul celulei. Și te poți gândi la asta ca la o chiuvetă care îl elimină din populația liberă de... pentru fiecare moleculă x. Și aceasta poate fi reformulată ca o matrice stoichiometrică [? deci ?] ij, unde sunt în principal 1 și minus 1. După cum puteți vedea, în fața fiecăruia dintre aceste fluxuri, degradarea sintezei și așa mai departe vor fi 1 și minus 1 care se referă la stoichiometrie și uneori 2 și 0. Și atunci transportul este propriul său vector. Și veți vedea utilitatea matricei stoichiometrice unde i este numărul metabolitului și j este numărul reacției sau numărul enzimei pentru toate reacțiile posibile care pot avea loc într-o celulă. Acestea pot fi toate reacțiile posibile. Apoi le puteți activa și dezactiva cu mutații sau schimbând diferite tipuri de celule. Acum, acest sistem deosebit de bogat , celulele roșii din sânge, a fost modelat de mai multe ori și continuă să fie modelat de la mijlocul anilor '70 și acum până în anii 2000, începând inițial doar cu glicoliză, adăugând mai târziu fosfat de pentoză, metabolismul nucleotidelor, diverse [? pompe, ?] [ ? osmotic ?] consideraţie. Liganzii de hemoglobină au fost tratați din când în când și mai puțin problemele legate de [INAUDIBLE] și de formă. Niciun model nu include toate acestea într-un singur model, deși este într-adevăr foarte aproape. Dar există modele care includ tot metabolismul pe care îl cunoaștem și proprietățile osmotice de transport. Relativ puține dintre acestea au fost puse la dispoziție pe scară largă. Dar acum sunt din ce în ce mai disponibile gratuit pe web, așa cum ar trebui să fie modelele. Ipotezele din spatele acestui lucru sunt că, așa cum am spus, nu totul este modelat. Unele dintre ele, pentru comoditate matematică, de obicei, pentru a face ecuații diferențiale, deoarece există intervale vaste de constante de timp, de la lucruri care se întâmplă extrem de repede la lucruri care se întâmplă extrem de încet, de obicei, ceea ce faci este că vei model cu o fereastră în mijloc, unde veți spune, lucrurile care s-au întâmplat foarte repede pot fi tratate ca un pseudo-echilibru, așa cum am enumerat în această linie de mijloc aici, pe diapozitivul 10. Lucrurile care se întâmplă extrem de lent pot fi tratate ca o constantă. Dacă se întâmplă pe parcursul anilor, atunci în cursul unui experiment care ar putea dura ore, pot fi tratate ca o constantă sau ceva pe care îl explorezi sistematic. Deși, de obicei, vom ignora mici părți ale metabolismului, cum ar fi metabolismul [INAUDIBIL] calciu-- fie pe măsură ce datele vin din alte sisteme și încercăm să le tratăm prin omologie sau analogie. În plus, atunci când vorbim despre o celulă tipică, aceasta poate însemna că presupunem o distribuție omogenă a moleculelor în interiorul celulei și omogenitate de la celulă la celulă într-un anumit organism. De asemenea, înseamnă că există tendința de a modela un tip sălbatic fără a respecta polimorfismul. Deși în populația umană, cu funcția celulelor roșii din sânge în special, există destulă literatură despre mutațiile care afectează funcționarea proteinelor din celulele roșii din sânge. Probabil unul dintre cele mai bine studiate sisteme genetice umane. BINE. Suprafața nu este absolut constantă, deși deocamdată este modelată ca atare. Acestea sunt câteva exemple ale unui subset al acestuia. Acesta este un subset care se referă la glicoliză. Puteți vedea că toate au aceeași formă în care aveți o modificare a concentrației în moli pe litru în raport cu timpul unei molecule mici - aici glucoză-6-fosfat. Este o rată de sinteză, indicele fiind hexokinaza. Acesta este colțul din stânga sus. Și apoi aceasta este sinteza minus chiuvetele, ratele de degradare, care trec prin alte două enzime. Din nou, un memento-- în partea de jos, veți vedea că acesta apare de câteva ori, doar un memento. Fiecare dintre acestea este o formă de modificare a concentrației unei molecule mici în raport cu timpul - este suma sintezei, scăzând utilizarea transportului de degradare. BINE. Acum, amintiți-vă că ne-am concentrat pe o mică parte din asta de câteva ori acum. Acesta este un pas care se întâmplă să fie alosteric. Aceasta înseamnă că, în funcție de concentrația... partea superioară a acestei formule tinde să fie compusă din substraturi și produse care au efect. Și apoi acest termen din numitor are o a patra dependență de putere de o varietate de alți efectori de site, inclusiv AMP. Și puteți vedea că viteza este fie hiperbolică, care este curba superioară, care urcă fără probleme și crește platouri. În timp ce o curbă sigmoidă implică o mai mare cooperare, care poate fi afectată de unii dintre acești alți efectori de situs, care are o formă mai sigmoidă. Și vom folosi asta ca o piatră de temelie pentru a vorbi despre care sunt diferitele modalități de a obține acea formă de sigmoid? Am vorbit deja despre modul în care proteinele pot fi multimeri, dimeri, tetrameri și așa mai departe. Aceasta ar putea fi o modalitate de a obține forma sigmoidă printr- o schimbare a conformației care detectează al doilea loc. Dar despre un alt mod vom vorbi în doar câteva diapozitive. Când avem aici expresiile cinetice, ele au forma celei anterioare. Cele mai multe dintre ele sunt mai simple decât cel din diapozitivul 12. Modelul are un total de 44 de expresii rate. Au aproximativ cinci constante, în medie, deci aproximativ 200 de parametri. Acestea nu sunt cu adevărat ajustabile în sensul că sunt determinate din reacțiile in vitro. Ce fel de presupuneri? Am menționat deja diferența dintre in vitro și in vivo. Avem întrebarea persistentă despre câți efectori ar putea fi despre care nu știm? De obicei, aceste experimente in vitro au fost făcute cu un număr mic de substraturi și produse despre care știți. Dar, în cel mai rău caz, lui Mike Savageau îi place să scoată glutamina sintetaza, care, din fericire, nu este în acest model special. Dar s-ar putea să existe o enzimă care este la fel de complicată, dar care nu a fost studiată la fel de mult. În cazul glutamin sintetazei, există trei substraturi. Amintiți-vă, exemplul anterior, au existat doar două substraturi și două produse. Glutamina sintetaza, trei substraturi, trei produse și are nouă efectori alosterici, mai degrabă decât cei trei sau cam asa ceva din exemplul anterior. Deci, aceasta oferă un total mare de 15 molecule diferite pe care trebuie să le urmăriți. Deci, numărul de măsurători diferite pe care s- ar putea să trebuie să le faci, ipotetic... nimeni nu a făcut efectiv acest număr de măsurători. Dar lui Mike Savageau îi place să sublinieze că, chiar dacă ai făcut doar patru puncte de concentrare în acest spațiu multidimensional, ai de la 4 la a 15-a măsurători, sau un miliard de măsurători. Un miliard nu este nici pe departe la fel de intimidant ca atunci când a făcut această declarație în '76, dar încă nu este ceva ce se face în mod obișnuit. Ce alte constrângeri? Există aceste constrângeri fizico-chimice ale presiunii osmotice și neutralității electronilor, menționate aici puțin mai explicit. Ai pi i egal cu pi e. Aceasta înseamnă că presiunea din interior este egală cu presiunea din exterior. Pare o modalitate bună de a echilibra lucrurile, astfel încât celula să nu explodeze. Și în mod explicit, asta înseamnă că aceste constante de gaz r ori temperatura absolută, grade Kelvin, ori suma componentelor presiunii pentru molecula j, mergând până la m specii chimice, pentru că i, reprezentând Interior, este egală cu aceeași sum, sumă echivalentă pentru indicele e, pentru Exterior. Electroneutralitatea are același set de concentrații pentru moleculele i, interior și j, unde acum z este sarcina, unde sarcina este același z pe care l-am avut în m peste z pentru spectrometria de masă. Deci bine. Acum, unele dintre modelele pe care vi le ofer astăzi, le vom compara cu cele calculate și observate, așa cum am făcut și înainte. Și aici este arătat puțin diferit decât cum am făcut-o înainte și cum o vom face mai târziu. De obicei, am fi observat pe o axă și am fi calculat pe cealaltă. În general, căutăm valori aberante. Și aici sortăm după gradul în care se abat de la observație. Și astfel abaterea va fi observație minus calculată. Iar gradul de abatere poate fi fie normalizat la abaterea standard, ceea ce înseamnă practic normalizarea acestuia la cât de încrezători suntem în măsura experimentală. Sau poate fi normalizat la valoarea medie, care apoi devine mai puțin dependentă de acuratețea experimentului și mai dependentă de-- cu o fracțiune din-- și așa am sortat-o ​​pe scară. Și puteți vedea că majoritatea dintre ele sunt mai puțin de două standard-- îmi pare rău. Abaterea este mai mică de două ori valoarea medie și mai puțin de șapte abateri standard în ceea ce privește măsurătorile. Dar cele care se află cel mai în dreapta sunt în mod clar cele care necesită cea mai mare atenție, fie în măsurătorile experimentale, fie în modelare. Acestea sunt măsuri de echilibru. Acesta este un fel de abuz al unui model cinetic frumos. Dar reflectă datele limitate care există. Și este mult mai ușor să colectezi date la starea de echilibru în cazul în care, practic, celulele roșii din sânge - fiecare moleculă anume, chiar dacă există fluxuri în și din fiecare moleculă, concentrația moleculei în sine rămâne constantă. Deci, așa... dacă presupui că fiecare concentrație moleculară rămâne constantă în timp, măsori doar niveluri la starea de echilibru. Dar dacă sunteți mai interesat să priviți dinamica, filmul despre cum se vor schimba moleculele dacă perturbați sistemul, vă puteți gândi la o mare varietate de curbe diferite pe care le pot lua cursurile de timp. Și atunci provocarea este cum îi reprezinți? Ai 40 de molecule mici diferite. Urmăriți concentrațiile. Și apoi cursul de timp poate varia peste ore. Dar o modalitate de a face acest lucru este să faci perechi de substraturi odată, substratul a și b, și apoi să monitorizezi cursul timpului ca vector. Gândiți-vă la acestea ca la o serie de mici puncte de aici. Și să ne uităm în diapozitivul 17, să vedem în stânga sus, numărul 1. Dacă, să spunem, a este convertit în b, astfel încât a plus b este egal cu o constantă, puteți vedea această pantă de negativ 1. Aceasta este exact negativ 1, deoarece pentru fiecare moleculă de a care este consumată, se produce o moleculă de b. Și atunci când vedeți această pantă perfectă de negativ 1, atunci acesta este genul de relație la care vă așteptați între cei doi, chiar dacă eșantionați aleatoriu un sistem dinamic. Aici faci un curs de timp. Numărul doi este o pereche de concentrații [? în echilibrul ?] . Veți obține o constantă de echilibru, iar rapoartele de aici nu vor fi negative 1. Vor fi o constantă care determină acel echilibru. Aveți doi metaboliți independenți dinamic, ca în cadranul III de aici. Practic, pe măsură ce treceți prin creșterea lui b, a poate rămâne constantă pentru că nu-i pasă cu adevărat. Nu răspunde la modificările din b sau modificările care au ca rezultat schimbarea b. Și atunci poate că un alt set de dinamică va face ca a să se schimbe, iar b rămâne constant. Și dacă eșantionați suficient curs de timp, s- ar putea să descoperiți că aceasta umple întregul spațiu de concentrații disponibile pentru a și b, fără a prezenta nicio corelație. Un alt tip interesant de fenomene pe care îl puteți vedea este că nu toate concentrațiile posibile de a-- și nu sunt complet independente de b. Așa cum ați putea începe dintr-un anumit punct dintr-o serie temporală de la acest decalaj aici, în dreapta jos - și începeți să scădeți b și să creșteți a. Și apoi, la un moment dat, dinamica întregii rețele, nu doar a și b, contribuie acum la a se scufunda în jos și b crește. Și, în cele din urmă, te întorci la acel punct de stare staționară și ai descris toate condițiile pe care ai putea să le atingi în această buclă închisă. Deci ne vom uita la acest tip de diagrame de fază. Concentrația a versus concentrația b-- unde o serie de puncte de timp care ar fi codificate cu culori. Acestea pot fi fie grupate, așa cum sunt în această diagramă, fie în următorul diapozitiv, le vom vedea separați câte un metabolit. Dar este același concept, indiferent dacă aveți un grup de metaboliți implicați în glicoliză adunați împreună, în comparație, de exemplu, cu un grup care sunt redox. Aveți în stânga jos a fiecăruia dintre aceste cadrane este această serie de timp la care ne-am uitat. Iar partea superioară sunt coeficienții de corelație, codați în culori, astfel încât albastrul este o corelație negativă, iar griul este o corelație pozitivă foarte semnificativă, iar orice altceva este ceva între ele. Deci ceea ce vedeți din acestea este că vedeți, de exemplu, iată această curbă în sus care este foarte aproape de curba negativă 1, ca și cum ar exista o reacție de conservare aici între glicoliză și treptele adiacente. Vedeți bucle mici, de exemplu, în stânga jos, biosinteza adeninei, în acel rând și așa mai departe. Vedeți exemple de fiecare dintre aceste tipuri de comportamente aici, unde treceți de la punctul roșu - aceste puncte mici în roșu - la verde la albastru la galben până la sfârșitul gri, în timp crescând grosieritatea, începând cu 0,1 ore. rezoluție și se termină cu o rezoluție de 300 de ore. Aceasta este aglomerație, în care ne uităm la lucruri precum ATP și încărcături redox. Acum, dacă ne uităm la ea o moleculă la un moment dat, evident că veți obține o combinație mai complexă - obțineți fiecare combinație posibilă de molecule pe perechi. Și puteți vedea această dinamică completă. Acum, acestea nu sunt date. Toate acestea sunt simulări. Și, din păcate, nu avem încă acest tip de rezoluție dinamică în datele experimentale. Dar asta vă dă o idee. Dacă vedeți aici un fenomen deosebit de interesant, atunci ar putea fi o motivație pentru a intra și a analiza datele mai detaliat. BINE. Acum, am menționat această diferență între curba hiperbolică obișnuită - în partea dreaptă jos a întregului diapozitiv, partea stângă sus a insertului - și curba sigmoidă pe care o obțineți dintr-o interacțiune alosterică. Și în-- toată această celulă este pregătită pentru transportul oxigenului. Și pe măsură ce concentrația de oxigen crește pentru hemoglobină, fie veți obține această curbă hiperbolică sau sigmoidă, pe măsură ce devine din ce în ce mai sigmoidă, din ce în ce mai cooperantă, cu cantități tot mai mari de unul dintre metaboliții intermediari, 2, 3 difosfogliserat. Și puteți vedea, aceasta este acum legătura dintre calea glicolitică. Reglarea este detectarea stării căii glicolitice și a hemoglobinei. În plus, există legături cu pH-ul, care este, de asemenea, reglat în acest sens, și redox. Puteți vedea chiar deasupra ei aici, hemoglobina trecând la starea neproductivă de methemoglobină. Deci, puteți vedea că există conexiuni în rețea între această funcție finală, care este transportul oxigenului, și toate aceste componente intermediare ale metabolismului . Și ne aduce și la acest subiect, din nou, al acestei cooperativități și cum apare ea aici? Și hemoglobina are o schimbare a stării conformației tetramerice , adică există un al doilea loc care leagă acest difosfogliserat organic. Dar o altă direcție pe care o putem lua -- așa că în colțul din stânga jos al diapozitivului 21 este din nou aceeași pictogramă a modului în care devenim din ce în ce mai cooperanți de la hiperbolic la sigmoidal, până la punctul în care aceasta devine aproape verticală și deplasată de la origine, astfel încât celula, la un moment bun ca răspuns la un stimul, va lua decizia de a se angaja în următoarea fază a diviziunii celulare. Aceasta este similară cu diviziunea celulară despre care am vorbit mai devreme în contextul analizei microarray a diviziunii celulare de drojdie. Aici vorbim despre un ovocit amfibian Xenopus , care are celule mari drăguțe pentru a face acest tip de studiu. Unde trebuie să decizi să ieși din G1 și să te angajezi să sintetizezi ADN-- în faza S, în partea inferioară a cercului, de unde obții, acum, două molecule de ADN. Și odată ce ești convins că ai terminat de replicat tot ADN-ul tău, abia în acel moment, te poți angaja la mitoză, o altă decizie majoră. Și apoi obțineți două celule și vă întoarceți și finalizați ciclul celular. Micul curs al timpului din partea de jos aici ar trebui să vă amintească de cursul timpului pe care l-am avut despre sinteza ARN a diferitelor grupuri de ARN. Aici este sinteza ADN-ului. Puteți vedea că crește în faza roșie S și apoi scade în metafază datorită creării a două noi celule. Dar vrem să vorbim despre cum facem acest lucru la fel de receptiv ca, să zicem, progesteronul sau ceva care semnalează celulele care ar putea aștepta perioade lungi de timp pentru a finaliza următorul pas dintr-un ciclu de diviziune pentru un stimul hormonal extern că este timpul. pentru a începe următorul pas în ciclul celular? Vrem ca aceasta să fie deplasată de la origine. Nu vrei să fie doar pornit și oprit, indiferent de un stimul. Dar când se răstoarnă, vrei să meargă foarte repede. Deci cum am modela asta? Așa că uitați-vă la diagrama din dreapta sus a diapozitivului 22. Și aveți un set de aceste ovocite care indică schematic starea lor. Starea lor este determinată de în ce măsură sunt gata să se angajeze în următorul stat de divizare? Aici ne putem gândi la el ca biomarker-ul este starea de fosforilare a unei proteine ​​MAP kinazei. Dacă este fosforilat, atunci este dedicat acestei diviziuni. Și ne putem gândi la aceasta ca latura neagră a acestui gradient, mergând de la alb la negru. Dar dacă măcinați o întreagă populație de aceste ovocite și măsurați fosforilarea totală a MAP kinazei în funcție de creșterea stimulului, S-- în acest caz progesteron-- răspunsul -- adică starea fosforilată și angajamentul de a mitoza-- va crește treptat, așa cum este indicat în modelul gradient. Dar asta dacă împrăștii toate celulele. Dar cealaltă modalitate de a obține acel rezultat ar fi dacă fiecare celulă ia o decizie cu totul sau nimic. Și ceea ce se întâmplă este probabilitatea ca o celulă să se afle în această stare sau nici una se schimbă odată cu creșterea stimulului la progesteron. Și acesta este modelul inferior și este, de fapt, mai aproape de realitate, așa cum este indicat de experimentul din partea de jos a slide-ului de aici, unde aveți -- aceasta este o parte a unei curbe de concentrare în care creșteți stimulul progesteron. Dar la acest stimul special, puteți eșantiona celule individuale. Există suficientă celulă încât să poți face proteomică pe celule individuale. Și proteomica de aici este un western blot. Am menționat asta cu câteva prelegeri în urmă. Și aici puteți vedea cele două stări ale kinazei MAP. Starea fosforilată este mai lentă. Din punct de vedere electroforetic, este banda superioară din această diagramă. Și banda inferioară este starea nefosforilată. Și puteți vedea că aici nu există niciun exemplu de celulă care se află într-o stare intermediară, în care are jumătate și jumătate sau 40/60 din cele două forme diferite de proteine . Totuși, dacă tu, ca experiment de gândire, ai lua toate acele celule și le-ai zdrobit, și ai lua asta și ai rula totul pe o singură bandă, ai vedea un amestec. Veți vedea toate stările intermediare, iar aceasta ar fi o funcție a progesteronului. Deci acesta este un avertisment, asemănător celor pe care le-am spus înainte, că atunci când măcinați totul și amestecați populații de celule sau molecule, trebuie să fiți atenți, deoarece celulele diferite pot fi în stări diferite, molecule diferite pot fi în diferite stări. state. Și comportamentul mediu nu este același cu cel al individului. Dar acum, asta este doar o parte a lecției aici. Celulele trec prin acest proces, totul sau niciunul. Îl putem monitoriza prin proteomică unicelulară. Dar cum îl modelăm? Ei bine, în termeni foarte abstracti , răspunsul de aici poate fi modelat ca în acest coeficient Hill, unde aveți un stimul, s, o constantă cinetică, k-- cam ca o constantă Michaelis-- unde este practic, pe măsură ce se apropie s la k, are un răspuns mai mare aici, efect asupra răspunsului. Și asta este neliniar pentru că aveți exponentul h. Și cu cât h este mai mare, cu atât este mai neliniar. Deci, să presupunem că h este 1 în această mică schemă din dreapta aici. Este hiperbolic. Nici un caracter sigmoid. In cazul hemoglobinei si fosfofructokinazei despre care am vorbit in hematia este mai mult sigmoidal, ca o h de 2,8, aproape legea cubului acolo. Și, de fapt, chiar și în cadrul acestui sistem, unul dintre pașii despre care vom vorbi în următorul diapozitiv -- în cazul în care aveți un stimul al unei proteine ​​Mos și un răspuns al aceluiași răspuns de fosforilare a kinazei MAP , are un sigmoid modest. Coeficient Hill de 3, la fel ca hemoglobina. Dar răspunsul global al kinazei MAP la progesteron are un exponent enorm de 42. Asta înseamnă că este aproape vertical și este deplasat de la origine. Cum obținem asta? BINE. Deci... hopa. Deci iată un model propus. Și este un instantaneu interesant în evoluția inevitabilă a unui model de la ceva foarte primitiv, care ar fi putut fi doar efectele Mos asupra kinazei MAP, un fel de efect direct aici, care, așa cum am spus, are un coeficient Hill de aproximativ trei ori. - scuze. Coeficient Hill de 3, nu triplu, pentru că este un exponențial. Dar, per total, combinație de alți doi factori care ai un lanț de modificatori, fiecare aproape de saturație, ceea ce înseamnă că fiecare are un comportament ușor sigmoid. Și ai... îmi pare rău. Ar putea fi o funcție hiperbolică, cum ar fi, să spunem doar, această linie punctată care urcă lin de la 0, unde spune „nici”. Acesta ar fi efectul, dacă ai doar o reacție enzimatică normală, fără alosterie, fără feedback, fără ultrasensibilitate. Dacă fiecare dintre ele are o componentă și ești aproape de saturație, adică substratul tău este foarte ridicat. Și astfel mergi la fel de repede cum va merge enzima. Ai un lanț din acestea. Puteți demonstra prin modelarea cinetică că aceasta va crea o sensibilitate ridicată la reacție. Și asta este cea mai îndepărtată curbă punctată aproape de axă , doar ultrasensibilitatea. Și apoi, aici, aveți progesteron care intră, în stânga sus, afectând o rată complicată. Acum, aceste constante de viteză nu înseamnă neapărat un pas cinetic unitar, simplu. Ele pot reprezenta ceva la fel de complicat precum trecerea de la aminoacizi, AA, la o anumită proteină, Mos. Și apoi reacția inversă, k sub minus 1, este degradarea Mos înapoi la aminoacizi, care nu este inversul aceleiași enzime stabilite prin niciun mijloc. Următorul pas, k2, este mai simplu. Doar că Mos este fosforilat de, de fapt, prietenul nostru MAP kinaza în [? fosfor?], care produce -- pentru catalizarea fosforilării Mos, care catalizează o altă fosforilare a unei alte proteine, care apoi stimulează pozitiv MAP kinaza însăși. Deci toată chestia asta este un set de reacții pozitive. Fiecare dintre fosfoproteine ​​crește tendința enzimatică pentru fiecare dintre celelalte fosfoproteine de a fi produsă. Așa că puteți vedea că acest lucru este cam pe un declanșator de păr. Dacă oricare dintre aceste fosfoproteine ​​este produsă, atunci va crește pe toate celelalte și va fi o procedură foarte cooperantă. Și asta este ceea ce, cel mai îndepărtat spre axa din colțul din stânga jos, acolo unde aveți doar acest feedback pozitiv, provoacă această tendință foarte mare de a sări de la 0 la un răspuns foarte mare cu foarte puțin stimul. Ei bine, asta e periculos. Vrei să fie aproape vertical, dar nu vrei să fii aproape vertical la 0 stimul, pentru că este instabil. Deci vrei să-l muți. Și aici intervine ultrasensibilitatea, când aveți acest lanț de modificatori care le pun pe amândoi împreună ca o linie neagră solidă, unde este deplasată astfel încât să aveți... acest test a fost făcut cu Mos, mai degrabă decât progesteron, ca intrare. Dar puteți vedea cooperativitatea generală crescută și deplasarea la dreapta. Deci, acesta este un exemplu despre cum puteți obține acest coeficient Hill foarte mare și unde puteți obține bistabilitate fără stocastică. Vă puteți imagina că puteți avea bistabilitate stocastică. Dacă aveți o moleculă în celulă și fie este acolo, fie nu este, atunci aveți bistabilitate. Ai două stări pentru celulă. Fie este celula cu moleculă, fie fără. Dar aici puteți vedea că, chiar și cu o celulă foarte mare -- ovocitele de Xenopus fiind una dintre cele mai mari celule -- și cantități foarte mari de proteine ​​-- suficient încât să le puteți vedea cu ușurință în proteomică -- puteți totuși să obțineți bistabilitate cu modelul cinetic drept. Nu orice model aleator ar atinge acel coeficient Hill ridicat . BINE. Așa că vom menționa pe scurt cealaltă modalitate de a obține bistabilitatea, care este prin stocastică, atât de mici molecule. Și iată, un exemplu, așa că, în loc să aveți de-a face cu celule foarte mari cu un număr foarte mare de molecule implicate, aici, să zicem, bacterii în special, o bacterie infectată cu fagi , aveți în general cazul unor explozii foarte mici de activitate. Un factor de transcripție se va lega de un promotor. Înainte ca factorul de transcripție să se desprindă, poate provoca o explozie mică de câteva transcrieri de ARN realizate de câteva ARN polimeraze care văd acești factori de transcripție. Apoi, fiecare dintre acești ARN-uri a provocat propriile explozii de sinteză a proteinelor în care o serie întreagă de ribozomi se vor lega într-un polizom. Și vei obține această explozie dublă de ARN și proteine. Și legarea stocastică a acelui factor de transcripție care începe acea explozie poate fi modelată prin parametri măsurați în mod rezonabil pentru fiecare dintre acești pași. Și puteți vedea că celulele unu, doi și trei, în partea stângă jos a diapozitivului 25, unde timpul este axa orizontală până la, să zicem, 45 de minute sau o diviziune celulară sau două. În timp ce numărul de proteine ​​produse de aici, măsurat în dimeri de proteine, fluctuează, în cazul în care celula unu începe devreme, sparge timpurie, iar celula trei nu și-a lovit încă destul de mult. Deci puteți vedea că există o mulțime de variații. Și aceasta este o modalitate de a obține un comutator bistabil. Dar, după cum ați văzut, nu este singura cale. O poți face și acolo unde toate proteinele sunt prezente în cantități mari. Dacă alegeți să mergeți pe calea stocastică - și acesta ar putea fi un proiect interesant pentru unii dintre voi. Nu s-a dovedit în niciun caz a fi esențial pentru comunitatea de modelatori de sisteme. Dar mulți oameni cred că este o cale de urmat. S-au înregistrat progrese mari din 1977, când Gillespie a propus algoritmul numit după el pentru simularea stocastică, câteva reacții chimice în general, nu doar reacții biologice, biochimice . De atunci, Gibson și Bruck, în ultimii doi ani, au venit cu un algoritm, care este acum proporțional cu logaritmul numărului de reacții, mai degrabă decât cu numărul de reacții. De fiecare dată când treceți de la n la log n, acesta este un progres mare. Și acest lucru se face printr-o mai bună urmărire a calculelor pe care le puteți reutiliza. Așa că vă încurajez să aruncați o privire asupra acestui aspect al stocasticii. Un alt aspect este că oamenii cred adesea la stocastică ca pe un fel de pacoste. Acestea măresc timpul de calculator necesar pentru a face simulări. Acestea vă sporesc incertitudinea cu privire la simulările pe care le produceți apoi. Dar există un aspect al acestuia care abia începe să fie valorificat în diferite domenii ale ingineriei, iar ingineria biologică nu face excepție. Și vă dau aici două exemple pentru a vă stârni pofta de mâncare. Din nou, nu am de gând să trec prin ele. Dar puteți vedea că puteți face de fapt comutatoare și amplificatoare pentru expresia genelor -- expresia genelor fiind unul dintre subiectele noastre preferate din acest curs -- care se bazează pe zgomot și de unde puteți obține bistabilitate folosind aceste fluctuații. Și asta nu este prea neașteptat, pe baza a ceea ce tocmai am spus. Dar, în plus, puteți obține o focalizare stocastică acolo unde fluctuația permite o sensibilitate sporită. BINE. Așa că te încurajez să te uiți la asta. Acum, un loc special în care s- ar putea să vă faceți griji că stocastica intră destul de mult în joc este numărul de copii ale cromozomilor , fie că este vorba de cromozomi eucarioți sau, în cazul pe care îl vom ilustra, un caz foarte simplu de cromozomi plasmidici. Acum, lucrul interesant despre plasmide este că pot fi fie în pas cu diviziunea celulară, așa cum sunt cromozomii eucarioți, în cazurile de ovocite de Xenopus despre care tocmai am vorbit, unde ia o decizie importantă. Și acesta este cazul plasmidelor R1. Sau poate fi mai degrabă un nor de număr de copii, în care ei încearcă să fie aproape de un număr țintă în care veți avea mai multe copii decât una pe celulă. Și astfel, pe măsură ce celula se împarte, ea ia în mod aleatoriu o partiție din acel număr de plasmide. Și ColE1 este un exemplu în acest sens. Și îl modelezi pentru a determina factorii care îl guvernează. Acest lucru are implicații. Numărul copiei va afecta nivelurile de expresie. Iar nivelurile de expresie sunt importante pentru biotehnologie. Și plasmidele sunt, desigur, importante și în patogeneză. Numărul de copii afectează patogeneza, deoarece plasmidele sunt o modalitate majoră prin care elementele de rezistență la medicamente sunt transmise. Așa că haideți să aruncăm o privire la una, sperăm, o versiune extrem de simplificată a acesteia. Aici aveți două ARN, numite imaginativ ARN 1 și ARN 2. Vom începe-- ARN-ul 2 este transcris aici, pe firul de jos, de la dreapta la stânga. Deci, de fapt, uitați-vă la partea de jos a diapozitivei 30. ARN-polimeraza magenta produce ARN 2. Și dacă nimic nu se leagă de ARN-ul 2, dacă ARN-ul 1 nu se leagă de acesta, RNaza H îl va scinda. Apoi se va lega de ADN polimeraza albastră și va începe replicarea plasmidei. Pe de altă parte, dacă ARN-ul 1, care este produs pe catena opusă a ARN-ului 2-- este această poveste antisens. Apoi va veni și se va lega de ARN 2, un fel de trans. Acționează ca un inhibitor al tranzacțiilor. Este ajutat și încurajat de proteina Rom. Și acum nu obțineți scindarea RNazei H. Și astfel ADN polimeraza nu are un primer asupra căruia să acționeze și nu obțineți replicare. Și acesta este, desigur, nu doar un da sau nu. Acesta este ceva care este reglementat și îi permite să răspundă pentru a obține numărul corect de copie. Nu vrei să obțină un număr infinit de copii, altfel va sufoca celula care o adăpostește. Dar nu doriți ca acesta să scadă suficient de jos pentru ca apoi multe celule să se segregă fără copii ale plasmidei. Deci vrei să ai un echilibru de masă. Trebuie să aveți conservarea masei. Vrei să poți modela atât inițierea, cât și degradarea și inhibiția. Așa că faceți acest lucru făcând unele simplificări că rata RNază H este rapidă. Amintiți-vă că am avut reacții lente și rapide pe care le- am elimina, la fel și cu polimerizarea ADN-ului. Prin includerea concentrației de ARN 2 într-un model bazat pe ARN 1, îl puteți simplifica astfel încât să luați în considerare doar două specii, ARN-ul 1 și ADN-ul plasmid în sine. Le vom numi r și n pentru cele două molecule diferite. Deci acesta este doar o modalitate de a introduce un model cu două specii. Vom găsi o ecuație a vitezei de schimbare a ARN-ului 1 în funcție de timp. Și apoi următorul diapozitiv va arăta modificarea concentrației plasmidei. Concentrația ARN este r. Concentrația plasmidei este n. Avem dr dt și dn dt. Și acest lucru este foarte simplu. Este exact ca despre ce vorbeam cu metaboliții. Tu sintetizezi ARN-ul. Acesta este un termen pozitiv. Îl degradezi sau îl diluezi. Diluția se bazează pe rata de creștere. Mu este un tipic-- este folosit în ratele de creștere în genetica populației și aici este folosit în cinetica chimică. De fapt, acesta este, într-un anumit sens, un exemplu de domeniu foarte interesant în care reuniți genetica populației și cinetica chimică într-un singur loc. Și genetica populației și cinetica chimică, atunci când se unesc, unesc unele dintre cele mai disparate părți ale acestui curs. BINE. Deci acum avem o ecuație aici în care termenul pozitiv este k1, rata de inițiere a sintezei ARN. Și este, desigur, cu cât mai multe molecule, n, cu atât concentrația plasmidei este mai mare , apoi cu atât vei produce mai mult ARN . Deci, are sens că aveți produsul, constanta ratei înmulțite cu numărul de plasmide. În mod similar, pierderea acestuia va fi legată de numărul de ARN. Mai multe ARN-uri ai, cu cât vei pierde mai multe, cu atât mai mult ai de pierdut. Deci acesta este ARN-ul și acesta este pentru ADN. Aici aveți dependență de ARN. ARN-ul 1, amintiți-vă, este lucrul pe care l-am modelat în diapozitivul precedent -- este un inhibitor. Și așa va fi, atunci când se leagă de ARN 2 -- care este implicit modelat aici -- va avea această constantă inhibitorie în numitor. Și astfel, pe măsură ce ARN-ul inhibitor crește, acest termen inhibitor crește, rata înainte scade. Și rata de replicare va depinde și de numărul de copii ale plasmidei, așa că crește în interior. Rata de diluție depinde, desigur, și de n. Deci ideea, în următorul diapozitiv, va fi de a rezolva numărul plasmidei. Deci diapozitivul 34, avem cum ați implementa acele două ecuații pe care le-am avut în ultimele două diapozitive - sunt afișate în partea din stânga sus a slide-ului. dr dt este abreviat dr aici în format matematic. Este aceeași constantă k1 ori n este concentrația moleculelor plasmide. Atunci negativul este rata de degradare. Și diluția prin diviziune celulară, mu. Și asta este ori r, care este concentrația ARN inhibitor 1. Și într-un [? analiză ?] ecuația, pe care am văzut-o deja pentru moleculele plasmidei, n, modificarea concentrației lui n este o funcție de timp, dn dt, aici prescurtat dn, există. Și apoi o vom rezolva. Deci, primele trei lucruri sunt configurarea și solicitarea programului să o rezolve. Și o vom face sub constrângerile de dr dt este egal cu 0, dn dt este egal cu 0. Veți recunoaște acest lucru ca ipoteza de stare staționară. Chiar dacă există fluxuri de intrare și ieșire care sunt diferite de zero, efectul net este zero. Și deci aceasta este formula pentru starea de echilibru. Vom începe cu o rată de diluare de 1, unde veți avea un nivel de stare staționară. Și apoi vom urmări dinamica pe măsură ce trece la o rată de diluție care este mai lentă, adică rata de creștere este mai lentă. Și, deoarece rata de creștere este mai lentă, vă veți aștepta, poate, să acumulați mai multe molecule de plasmidă. Deoarece nu sunt în pas cu rata de diviziune celulară, celula crește mai lent. Și nu există un alt feedback și nu am pus niciun alt feedback în acest model, atunci ar trebui să meargă la aproximativ dublu nivel. Deci, faceți soluția simbolică din partea de sus aici. Și obțineți această soluție simbolică aici. Și dacă faci soluția numerică, NDSolve, atunci obții o soluție foarte asemănătoare. Și ai putea să-l complotezi. Aici trasezi y, care este un număr de copiere a plasmidei dintr-un interval de timp de la 0 la 3. Și poți vedea că crește de la puțin peste 1 la puțin peste 2 în ceea ce privește concentrația de plasmidă, așa cum te-ai putea aștepta din scăderea curbei de diluţie. Așa cum aveam modele stocastice pentru bistabilitatea despre care am vorbit mai devreme, bistabilitatea Xenopus ar putea fi continuă. Iar modelul lambda ar putea fi stocastic. Aici există modele stocastice pentru Copy Number Control, CNC, care sunt foarte interesante. Vă îndemn să vă uitați la ele-- unde puteți folosi, practic, modelarea stocastică pentru a face ceasuri moleculare, unde puteți reduce rata la pierderea plasmidei. Puteți vedea, în ultimul, dacă ați avea un număr foarte mic de molecule, ați avea o pierdere în unele dintre celule care ar fi modelate mai precis într-un model stocastic. Acum, vrem să trecem de la aceste modele de globule roșii în care aveți metabolism fără sinteza polimerilor și modelul CNC în care aveți sinteza polimerică a ARN și ADN-ului, dar fără metabolism, la o celulă mai integrată în care aveți amândoi. . Și doriți să reprezentați optimizarea completă care trebuie să aibă loc, obținerea metabolismului potrivit optim, astfel încât să obțineți tipurile potrivite de macromolecule produse într-o celulă complicată precum E. coli, care se poate adapta la o mare varietate de condiții de creștere diferite . Deci care sunt problemele aici? Numărul de parametri de care aveam nevoie și de care aveam pentru globulele roșii a fost enorm. Era 200. A fost un tur de forță să le obții. Pentru E. coli, este nevoie de ordine de mărime mai mult. Pentru că în loc de 40 de enzime, avem undeva între 400 și 4.000. Deci măsurarea parametrilor este o problemă. Și avem aceeași problemă în ceea ce privește in vitro versus in vivo. Avem același set de constrângeri. Și vrem să ne concentrăm mai mult atenția acum asupra constrângerilor de flux. Deci, după o scurtă pauză, vom reveni și vom vorbi despre echilibrul fluxului ca o soluție la acest lucru. Și așa cum am făcut cu celulele roșii din sânge, ne vom concentra asupra modalităților de a reexamina modul în care ne gândim la sinteza și degradarea moleculelor din această rețea pentru a vedea dacă putem reformula într-un mod în care poate pune întrebări interesante despre optimizarea acestor sisteme. Așa că ia o pauză rapidă. Și în a doua jumătate, vom vorbi despre echilibrul fluxului.