NARRATOR: Următorul conținut este furnizat de MIT OpenCourseWare sub o licență Creative Commons . Informații suplimentare despre licența noastră și MIT OpenCourseWare, în general, sunt disponibile la ocw.mit.edu. DR. GEORGE CHURCH: După cum am promis, vom trece la analiza echilibrului fluxului. Simplificarile de aici sunt chiar mai mari decat cele pe care le-am facut pana acum. Dar, sperăm, veți vedea unele beneficii. Au fost aici. Presupunând constanta de timp, reacțiile metabolice sunt foarte rapide în comparație cu creșterea celulară. Creșterea celulelor, am văzut că constantele de timp sunt de ordinul secundelor sau uneori mai puțin, în timp ce creșterea ar putea fi de ordinul orelor. Chiar dacă am văzut dinamici interesante care pot apărea, acele diagrame de fază pe care le-am avut în ecuațiile diferențiabile obișnuite, există și multe -- este foarte tipic ca o celulă să fie în condiții destul de stabile. Va exista un timp de tranziție și apoi vor fi din nou stabili. Și aceasta va fi ipoteza în starea de echilibru. Deci vom spune că nu există acumulare netă de metaboliți. Deci, chiar dacă pot exista fluxuri în și din fiecare metabolit, schimbarea netă este zero. Și asta înseamnă că această ecuație pe care am văzut-o de câteva ori, modificarea lui X va reflecta timpul este zero. Și asta înseamnă că matricea stoichiometrică înmulțită cu viteza fluxului pentru toate reacțiile relevante, la care te poți gândi ca o reprezentare matriceală. Suma tuturor intrărilor și ieșirilor respectivei poziții X, minus vectorul de transport, care este păstrat separat, este zero. Deci ce înseamnă asta? Aceasta înseamnă că matricea stoechiometrică înmulțită cu fluxurile interne este egală cu transportul prin membrană. Și acesta este ceva-- vă arăt-- vom face asta în doi pași. În primul rând, vom rezolva asta ca și cum ar fi un set exact de ecuații, doar numărul potrivit de ecuații, doar numărul potrivit de necunoscute. Deci, puteți obține o soluție pentru fluxurile necunoscute. Și apoi vom lucra acolo unde este de fapt subdeterminat, dar există constrângeri de inegalitate. În primul rând, să luăm cazul exact pentru că se știe stoichiometria care este S. Acestea sunt zerourile și unuurile, minus unu, doi și așa mai departe. Ratele de absorbție pot fi cunoscute în sensul că puteți regla cantitatea de intrare și ieșire prin rata la care îndepărtați substraturile și le adăugați. Și fluxul metabolic este ceea ce îți dorești de fapt. Acest lucru este în contrast cu celulele roșii din sânge sau cu alte cazuri obișnuite de ecuații de diferență despre care am vorbit. Unde se știau ecuațiile ratei, dar ce căutam concentrațiile. Aici suntem mai puțin preocupați de concentrații și vrem să aflăm care ar putea fi fluxurile și mai târziu care ar putea fi fluxurile optime. Deci Slide 42, să spunem că noi... ca, într-un fel, nomenclatură, ne concentrăm pe fluxurile pozitive. Dacă vrem să mergem în direcția opusă, vom face un alt flux invers, flux separat. Deci, concentrându-ne pe fluxurile pozitive, s- ar putea să cunoaștem nivelul fluxului în anumite reacții care ne vor ajuta să avem ecuațiile constrânse în mod corespunzător. Putem controla ratele de actualizare. Putem avea valori maxime de absorbție în fluxurile interne. Deci iată un exemplu. Să trecem prin el. Este frumos să avem câteva... unul sau două exemple în care parcurgem o anumită clasă. Deci, aici, vom avea o moleculă de intrare A este transportată prin membrană cu o viteză R sub A. Apoi, are, în esență, o furcă de decizie aici. O parte din A va trece prin reacția X1, iar o parte prin X2. Suma care trece prin X1 și X2 este ceea ce vrem să știm. O să ni se dea..., în esență, vom controla viteza cu care trece prin membrana RA. Deci asta va fi un dat. Puteți vedea constrângerea aici. RA va fi 3. Și vom ști, de asemenea, rata cu care B este îndepărtat, iar aceasta va fi menținută constantă la unu. Deci vom rezolva cele două fluxuri interne X și poate că acest flux de transport extern este C. Acum, va fi conservarea masei, așa că putem începe să stabilim echilibrele de flux în colțul din dreapta sus aici. din diapozitivul 43. Uitați-vă la A. A este creat -- în esență, concentrația intracelulară a lui A este dependentă de R sub A și apoi se împarte în X1 și X2. Deci știți că R sub A minus X1, minus X2 va fi zero. Se vor anula deoarece A, o ipoteză în stare de echilibru, va fi constantă. Chiar dacă fluxurile nu sunt zero, suma există. Și pentru B, se poate face un argument similar X1, care creează că B trebuie să fie de asemenea zero. Și același lucru pentru C, toate intrările trebuie să fie ieșirile. Avem aceste două constrângeri în care tocmai am spus că vom strânge experimental cantitatea de A care intră și cantitatea de B care iese. Și vrem să rezolvăm pentru ceilalți trei parametri cinetici. Deci avem trei ecuații și trei necunoscute. Necunoscutele sunt cele două fluxuri interne din R sub B. Și astfel, un alt mod de a afirma această ecuație X1 plus X2 este egal cu 3, deoarece știm că trei intrări trebuie să egaleze X1, X2 prin echilibrul fluxului. Acesta este, în esență, echilibrul de flux pentru A poate fi rezumat ca X1 plus X2 este egal cu 3. Sau în formarea matricei, este rândul de sus aici 1, 1, 0. În regulă, iar 3 este în vectorul coloană de transport la partea extremă dreaptă. Și, în mod similar, umpleți restul matricei simetrice cu zerouri și unu și doi și minus unu și transportul, vectorii de flux sunt 3, 1, 0, pentru constrângerile pe care le avem. Și rezolvi pentru asta. Trei ecuații, trei necunoscute. O poți rezolva... trucurile mele standard de algebră liniară S ori B egal. Deci V este egal cu matricea inversă S ori B. Matricea pe care am avut-o în diapozitivul anterior, care a fost primul rând a fost 1, 1, 0. Acum, când faceți matricea inversă, obțineți această porțiune din dreapta sus , și îl înmulțiți și obțineți soluția vectorială coloană care este 1, 2, 4, pentru X1, X2 și, respectiv, R, C. Acum, sunt conectați în această diagramă și puteți vedea că întreaga masă se echilibrează. 3 este egal cu 1 plus 2, de 2 ori C, de 2 ori 2 este egal cu 4. OK. Acesta este un exemplu în care este puternic constrâns și, prin urmare, îl putem rezolva exact. Cu toate acestea, de foarte multe ori, nu există [AUDIO OUT] dintre măsurătorile care au fost efectuate. Nu putem fixa toate aceste fluxuri și există mult mai multe fluxuri interne decât externe. Și așa avem un sistem subdeterminat. Ce ar trebui să facă un biolog de sistem bun în acest moment? Ei bine, soluția formală este că nu mai este un punct, un singur punct, un vector coloană frumos de fluxuri. Acum este un întreg spațiu fezabil. Acesta este un fel de răspuns de respingere, este că, OK, avem mai puține ecuații decât avem necunoscute. Asta înseamnă că necunoscutele pot ocupa întreg acest spațiu multidimensional, unde oricât de multe fluxuri ai, dacă ai sute de fluxuri, vei avea sute de dimensiuni. Aveți trei fluxuri, A, B și C. Apoi veți obține acest tip de regiune poliedrică multidimensională și orice în interiorul acelui poliedru este soluția acceptabilă pentru mulțimea subdeterminată. Ei bine, acesta este încă un progres în sensul că acum știi că soluția ta este acolo undeva. Dar dacă am vrea să găsim... să adăugăm mai multe constrângeri, care acum nu mai sunt constrângeri exacte, dar sunt mai degrabă un proces de optimizare. Este posibil să aveți că acest poliedru multidimensional va fi mărginit de inegalități. Că este mai mic decât... este mai mare decât zero. Corect, că este pozitiv, sau este mai puțin un flux maxim. Dar apoi doriți să găsiți o soluție optimă, iar optimizarea este lucrul pentru care matematica a fost valorificată în alte domenii în afara noastră, cum ar fi economie. Când faceți planificarea transportului sau planificarea investițiilor economice și așa mai departe, doriți să știți cât de mult din resurse doriți să trimiteți către ruta X1? Și cât vrei să trimiți pe ruta X2? Foarte analog cu situația pe care am avut-o în slide-ul precedent. Și asta poate fi rezolvat prin programare liniară. Programarea liniară găsind adesea aplicații economice. Dar trebuie să ne întrebăm ce vrem să optimizăm? În economie, doriți să optimizați, de obicei, rezultatul final. Vrei să scazi costurile și să crești profiturile. Ceea ce avem aici este că avem acest lucru foarte frecvent întâlnit în multe sisteme metabolice în care aveți acest con de poliedru convex. Convex înseamnă doar că nu există mici lacune în el. Nu mici regiuni sculptate. Totul este cuprins. Această convexitate vă permite să luați acum o funcție obiectiv liniară , să spunem un plan multidimensional sau o linie pe care apoi o mutați prin acest spațiu convex. Și din moment ce nu există lacune în ea, în cele din urmă vă veți deplasa pe măsură ce mutați această funcție obiectiv în - funcția obiectiv devine din ce în ce mai bună pe măsură ce trece prin acest spațiu fezabil. În cele din urmă ajunge într-un punct în care părăsește spațiul fezabil și aceasta este valoarea maximă. Valoarea optimă pentru acea funcție obiectiv. Deci, putem folosi acest spațiu fezabil combinat cu această funcție obiectiv pentru a găsi unele optime. Acum, care este funcția obiectiv pe care vrem să o folosim? Și dacă am face celule roșii din sânge, funcția obiectivă ar putea fi ATP sau redox sau ambele sau livrarea de oxigen. Și pentru o varietate de alte sisteme de importanță pentru înțelegerea producției de sănătate sau biotehnologie , sau alte obiective medicale și de inginerie, ceea ce dorim să optimizăm este biomasa. Capacitatea celulelor de a crește și de a produce alte celule sau de a produce un anumit subset de molecule în celulă, dar să ne ocupăm în principal de cazul celulelor producătoare de celule. Și aceasta este o sumă peste toți monomerii, toate componentele celulei, care reprezintă corpul celulei. Deci, pe măsură ce vă mișcați... pe măsură ce transportați molecule mici din mediul înconjurător și le încorporați în celulă, așa cum vă puteți gândi la ea ca la o sincronizare, îndepărtează acele molecule din circulație dintr-o soluție. Și această sumă peste toate componentele, raporturile, monomerii, vă puteți gândi că există un raport fix de alanină la glicină și leucină față de toate celelalte componente ale celulei. Și asta se știe. Puteți ști acest lucru fără a cunoaște o mulțime de alte părți ale sistemului pe care vrem să le cunoaștem doar luând celula și făcând o compoziție chimică pe ea. Experiment foarte simplu. Există tabele cu această varietate de celule cunoscute. Și cu greu se schimbă în funcție de modul în care crește o celulă. Ce surse de carbon și azot nu afectează în mare măsură raportul dintre alanină, leucină și glicină, deoarece acestea sunt determinate de ceea ce este necesar pentru a funcționa celula. Deci, acest lucru este important, fluxul, vă puteți gândi la acesta ca un fel de flux concentrat, iar aceasta va fi și funcția noastră obiectivă. Deci funcția obiectiv Z este numită uneori, deci Z va fi egal cu fluxul de creștere. Deci, puteți vedea că aveți, din nou, aceeași ecuație față de matricea chimică, ori fluxul intern este egal cu fluxurile de absorbție. Și avem asta acum - această constrângere, această funcție de optimizare. Deci, să luăm -- la fel cum am avut o soluție exactă foarte simplă înainte, acum să luăm această programare liniară foarte simplă sau soluție LPM unde acum este subdeterminată, așa că nu putem obține soluția exactă. Dar ne putem întreba care este maximul pentru o anumită funcție obiectiv. Funcția obiectivă aici nu va fi producția de biomasă a întregii celule. Va fi fie maximizarea producției de D sau C. Acum, aceasta este o diagramă ușor diferită de cea pe care o aveam înainte. Mai avem rata de absorbție a lui A pe partea stângă a acestui tip de pseudocelulă circulară. A intră. Ea ia aceeași decizie binară - decizia bidirecțională a X1 versus X2. Nu este binar. Aceste numere reale cantitative determină cât X și cât X2. Și apoi, dacă ia calea superioară X1, atunci se împarte în B și C. Dacă urmează ruta X2, se transformă în B și D. În ambele cazuri, produce o moleculă B. Puteți vedea deja o constrângere care vine aici, și anume RA va fi pentru RB. Oricum ai merge din nou de la A la exterior, va produce o moleculă de B pentru fiecare moleculă A. Aceasta este o reacție de conservare perfectă. Și am spus că suntem interesați doar de fluxurile pozitive, așa că obțineți acest mic triunghi aici de X1 și X2 sunt mai mari decât zero. Și sunt constrânși și am spus că RA o vom prinde astfel încât să nu aibă mai mult de o matriță arbitrară pe litru, pe minut. Și deci X1 plus X2 sunt constrânși să fie mai mici decât RA, deci sunt de asemenea mai mici decât 1. Deci obțineți acest spațiu fezabil, care este această regiune hașurată în diagonală, și aceasta este soluția exactă. Acesta este setul tuturor soluțiilor exacte. Dar acum, dacă dorim să maximizăm o anumită funcție obiectiv Z, în acest caz, să maximizăm producția lui D și nu suntem prea preocupați de nimic altceva. Atunci primești această linie. Puteți crede că acesta este un hiper-plan care merge -- o linie care, practic, urcă prin spațiul fezabil, începând din partea de jos a slide-ului, urcând și sus și sus până când abia părăsește spațiul fezabil. Și când o face, ultimul punct la care ajunge este maximul, iar maximul se întâmplă aici să fie X1 egal cu 0, X2 egal cu RD max. Rata maximă de producție a moleculei care ne interesează. Dacă am avea o funcție obiectiv care a ieșit de pe cealaltă axă, ar fi X2 zero și X1 egal cu RC maxim. Deci puteți vedea cum funcționează. Creăm spațiul fezabil cu această funcție de proiectare și obiectiv Z și rulăm Z de la marginea acestui spațiu convex. Este important să fie convex. OK, deci cât de aplicabilă este această programare liniară și așa-numita analiză a echilibrului de flux? Funcționează atunci când stoichiometria este bine cunoscută. Pentru E coli, este bine cunoscut. Pentru genomii nou secvenționați, putem face conexiuni cu reacțiile enzimatice anterioare. Și putem ghici care ar fi matricea stoichiometrică. Dar în acest caz, stoichiometria este mai puțin cunoscută și, caz în care, va trebui să vă îmbrățișați cu adevărat valorile aberante. Când ajungeți la N, veți vedea toate erorile și veți reveni și veți da seama ce a fost în neregulă cu matricea noastră stoichiometrică derivată din genomul nostru. Nu aveți nevoie de multe informații experimentale pentru a rula acest lucru. Dar aveți nevoie de câteva, iar noi vom explora două dintre ele sau cel puțin pentru a testa cum vor funcționa datele. Deci, care sunt precursorii creșterii celulare pe care îi monitorizăm ca funcție Z? Vrem să venim cu... să definim această funcție de creștere în termeni de biomasă. Și așa cum am spus, există tabele de compoziție pe care le vom arăta în câteva diapozitive. Dar îl puteți folosi ca parte a rețelei metabolice complete. Puteți utiliza aceasta și ca funcție de observare. Poate fi descris ca un număr mic de precursori biosintetici, plus cofactorii de energie și redox. Acum există multe moduri de a face în celulele silico. Arătăm ecuația obișnuită a celulelor roșii din sânge. Genul de celule in silico de aici unde optimizarea este destul de limitată, matricele stoichiometrice au fost elaborate doar pentru trei, poate cinci celule, trei publicate. Drojdia este pe drum. Și acestea sunt în mare parte îngrijite manual. Există cu siguranță o nevoie de a obține o intrare mai automată de la modelele genomice la aceste analize de flux. Iată câteva referințe aici. Vom vorbi într-o clipă. În primul rând, vom vorbi despre cazul de tip sălbatic pentru fiecare dintre aceste celule într- o varietate de condiții de creștere diferite . Apoi vom trece la mutanți și vom întreba dacă mutanții pe care ne așteptăm să fie optimi sau nu. Și asta se va numi minimizarea ajustării metabolice. Acum, de unde provin aceste matrici stoichiometrice ? Din paranteză, parametrii cinetici despre care vorbim sunt cunoscuți pentru unele dintre aceste sisteme biochimice complicate, nu doar pentru celulele roșii din sânge. Și de unde provin atât matricele stoichiometrice, cât și parametrii cinetici, desigur, deoarece o vastă literatură este o literatură greoaie în sensul în care a fost făcută într-un moment înainte ca cineva să creadă că vom fi... că vor fi responsabil pentru introducerea acestui lucru în bazele de date acceptabile de computer. Deci, în cea mai mare parte, a fost reintrodus de tehnicieni în baze de date și veți ajunge cu aceste diagrame, cum ar fi cea centrală în care fiecare dintre aceste casete conține este un nod care conține un substrat. Și liniile au numere de informații interioare astfel punctate - acest punct zecimal multiplu care arată o clasificare ierarhică care merge de la stânga la dreapta, care devine din ce în ce mai detaliată în reacția enzimatică. Și aceasta este construită într-o bază de date. Și de aici, puteți accesa lucruri precum efectele constantelor cinetice, efectele pH-ului și alte detalii. Și, de asemenea, din aceasta, puteți obține matricele stoichiometrice în principiu, deoarece aici, puteți vedea că aveți, să zicem, o intrare de ADP plus glucoză 6 fosfat care intră în această reacție sau iese în funcție de direcția în care vă aflați. mergând. Și așa se convertesc în zerouri și unu în matrice. Aceasta este sursa matricei stoichiometrice, care vă spune ce reacții sunt permise. Ce două lucruri pot veni împreună sau un lucru poate fi convertit de diferitele enzime care există de fapt în celule. Și le puteți activa și dezactiva, fie prin reglementare, fie prin schimbare evolutivă, fie prin manipulare genetică sau mutageneză. Practic, poți avea o matrice universală și le activezi doar pe cele care crezi că se întâmplă în organismul tău. Așa obțineți matricea stoichiometrică. Cum obțineți funcția de optimizare, funcția Z, care este modul în care doriți să luați acele decizii cu privire la cât X1 și cât X2. Acest lucru depinde de compoziția biomasei. Și compoziția biomasei, să spunem că o avem pe axa verticală aici, este coeficientul în reacția de creștere, care variază aici peste aproape opt logari din cea mai scăzută fracție compozițională, care sunt unele dintre aceste coenzime. Deci, la fel ca enzimele, sunt necesare doar în cantități mici față de acestea, care sunt necesare atât pentru participanții majori la sute de reacții, cum ar fi ATP. Unele dintre acestea contribuie în mare măsură la biomasă. Deci, ATP contribuie și la biomasă mare, cum ar fi ARN-ul ribozomal. Și apoi diferiți aminoacizi, care tind să fie multe dintre aceste stele la niveluri superioare, cum ar fi lizina, leucina și ceilalți 18 aminoacizi. OK, deci acestea sunt exemple de numere care ar intra în curba de optimizare aici. Aceste hiperplane roșii ar fi atât de liniare în raporturile din diapozitivul anterior. Acum, am văzut deja, am lucrat deja la un exemplu în care am alunecat unul dintre aceste hiperplane de la marginea unui model bidimensional și am obținut producția optimă a unei anumite substanțe D. Dar acum, suntem încercând să optimizeze această sumă liniară a tuturor metaboliților care intră în corpul organismului. Și concentrați-vă doar pe spațiul verde fezabil. De fapt, este... o parte din ele sunt ascunse în spatele galbenului, dar imaginați-vă acest întreg poliedru convex de verde care este spațiu fezabil, FS pentru tipul sălbatic, WT, și puteți obține un optim. Presupuneți că acest optim, indiferent de condițiile la care vă uitați, este probabil să fie atins, deoarece de milioane de ani, acest organism a trăit prin toate scenariile de creștere diferite. Glucoză pe glucoză, galactoză, diverse surse de azot și așa mai departe, așa că indiferent de set rezonabil de condiții pe care le- ai arunca, s-a mai văzut așa ceva înainte sau alte combinații, și deci este optim pentru asta. Și asta înseamnă punctul roșu din dreapta sus este că este optimul pentru tipul sălbatic. Mutarea acestui hiperplan, care este suma tuturor componentelor de creștere diferite în raportul corect. Deci, dacă veți optimiza toate deciziile, X1 și X2, astfel încât să obțineți proporțiile potrivite, astfel încât să nu obțineți prea mult, să zicem, din niște aminoacizi rar, cum ar fi triptofan și nu suficient de glicină, spune că alanina este cea mai comună. Este grozav pentru un tip sălbatic într-o varietate de condiții de creștere diferite. Dar dacă arunci o adevărată bilă curbă și spui să nu-i dai o condiție, ci să-i dai o perturbare, într-adevăr nu vede foarte des, dacă este deloc, ceea ce ar însemna eliminarea completă a genei prin ștergere sau, probabil, introducerea unei gene. . Adaugă o genă pe care nu a văzut-o până acum foarte des. Ei bine, acum ai putea spune că vom face aceeași optimizare. Vom rula același hiperplan roșu prin noul... așa că noul spațiu fezabil este redus dacă este un knockout, ar putea fi mărit dacă este un knock-in, unde adăugăm o genă. Dar în acest spațiu redus, optima originală nu mai este accesibilă. Și dacă reluați optimizarea rulând acest avion de pe margine, veți găsi un nou punct roșu în spațiul galben, care este un optim knockout. Dar asta ar putea dura... după ce faci knockout, ar putea dura timp evolutiv sau cel puțin timpi lb lungi pentru a permite tuturor celorlalte gene să se mute și să fie selectate astfel încât să găzduiască acest nou knockout. Că tipul sălbatic avea destul timp să facă asta avea milioane de ani. Este posibil ca spațiul galben fezabil pentru knockout să nu fi avut asta, așa că doriți să știți care este acest răspuns imediat. Și pentru răspunsul său imediat , vă puteți imagina că este afișat aici ca o ortogonală. Cea mai apropiată distanță este o distanță euclidiană în acest spațiu multidimensional între optimul de tip sălbatic și proiecția pe spațiul fezabil al mutantului. Acum, la această distanță, ar trebui să vă gândiți deja că aceasta nu mai este o programare liniară. Aceasta poate fi pătratică deoarece distanța este o funcție pătratică. Și vom vedea în special din moment ce există anumite patologii în care ești cu adevărat forțat să iei-- nu poți doar să faci o proiecție. Pentru că uneori, proiecțiile pot ajunge într-o parte a spațiului, ceea ce nu este fezabil. Această proiecție nu aterizează pe spațiul fezabil galben, FS al knockout-ului. Deci, ceea ce trebuie să faceți este să împingeți acest simbol violet până la cel mai apropiat punct al spațiului fezabil, ceea ce reduce la minimum distanța până la optimul de tip sălbatic și încă se încadrează în spațiul fezabil. Acum, acesta este un algoritm de programare pătratică. Este într-adevăr doar-- liniarul este foarte simplu de gândit ca doar mutarea acestui plan de la marginea spațiului convex. Vom merge mai sus... programarea pătratică este puțin mai complicată, dar cred că ai înțeles că minimizi acea distanță. OK, acum, cu orice exercițiu de modelare bun, ar trebui să existe niște date care pândesc în aripi. Multe dintre modelele de rețea pe care le vom face devin mai ambițioase chiar și chiar și cantitățile masive de date care vin. Există două tipuri de date care ar putea să vină în minte ca fiind adecvate pentru acest lucru. Amintiți-vă, am spus că ceea ce a făcut organismul este să optimizeze utilizarea acestor rețele, astfel încât să puteți maximiza creșterea. Așadar, cele două surse de date cu care ați dori să testați acest lucru ar fi datele fluxului în sine, deoarece spuneți -- preziceți cât de mult va merge în fiecare direcție de flux. Și datele de creștere, deci faceți predicții că veți folosi în mod optim fluxurile din rețea pentru a maximiza creșterea pentru diverși mutanți și diferite condiții de creștere, diferite surse de carbon și azot. Deci aici aveți un grup din Zurich, care este printre puținele grupuri care pot măsura fluxurile interne pentru căile metabolice care încep, de exemplu , cu glucoză etichetată izotopic și se termină în diferiți aminoacizi. Puteți măsura acestea - ne-am pregătit puțin pentru asta în ultima clasă în care am vorbit despre izotopomeri în care puteți avea diferiți compuși chimici a căror singură diferență - au practic identici din punct de vedere chimic. Dar în diferite poziții de carbon, aveți un carbon-13 într-un loc, carbon-12 în altul. Și aranjamentul exact al carbonului-12 și al carbonului-13 va determina izotopomerul. Și dacă aveți amestecuri de carbon-12 și carbon-13 glucoză-- în colțul din stânga sus al acestei diagrame include glicoliză și pentoză fosfat și ciclul TCA. Această glucoză marcată izotopic trece prin aici. Și apoi ai nevoie de puțină modelare în care nu vom intra. Dar asta necesită o matrice de stoichiometrie, la fel ca modelarea noastră de optimizare . Dar acum, foarte independent de asta, trebuie să vă întrebați cum izotopii glucozei își vor face drum în aminoacizi. Și apoi, odată ce ați avut asta, atunci având în vedere rapoartele de aminoacizi după spectrul de masă în RMN, puteți să vă întoarceți și să calculați care trebuie să fi fost fluxurile aici. Odată ce aveți aceste fluxuri, atunci vă puteți întreba cât de aproape de optime sunt pentru tipul sălbatic într-o singură condiție. Pentru mutanți, în aceeași condiție. Pentru tipul sălbatic și mutant în diferite condiții. OK, deci aceasta este prima clasă de date pe care o vom folosi și sunt fluxurile interne pentru tipul sălbatic și mutanții. Uită-te în colțul din dreapta sus, unde-- așa că în colțul din stânga sus este pictograma codificată în culori din diapozitivul anterior. Colțul din dreapta sus sunt predicțiile pentru tipul sălbatic folosind programarea liniară sau modelul FBA. Obțineți fluxuri prezise pe axa verticală și fluxuri experimentale pe axa orizontală. Vedeți, aici este un coeficient de corelație bun de aproximativ 90 plus la sută. Și o probabilitate ca acest lucru să nu fie întâmplător. Că aceasta este o corelație liniară pozitivă este mai bună decât 10 la minus 7. Foarte puțin probabil să se întâmple la întâmplare. Apoi vă puteți concentra pe valorile aberante, cum ar fi numărul 18 aici, dar, în general, este un bun... Adică, acest lucru vă poate permite să întrebați ce probleme experimentale sau de model ați putea avea. Dar să întrebăm... acesta este tipul sălbatic în condiții obișnuite de creștere . Dar mutanții în aceleași condiții de creștere? Aceeași modelare stoichiometrică, aceleași măsurători, acum fluxurile experimentale versus fluxurile prezise în cadranul din stânga jos sunt aproape complet aleatorii. Nu există o corelație pozitivă sau negativă care să fie semnificativă, așa cum ne-am fi așteptat pentru mutant. Amintiți-vă, nu este optim. Deci nu vă așteptați ca metoda de programare liniară care produce optimul să fie adecvată. Cu excepția cazului în care am permis ca acest lucru să evolueze în laborator pentru sute de generații sau un număr suficient, oricât de multe ar fi, pentru a face ca toate celelalte gene sau suficiente din celelalte gene să se adapteze, astfel încât să ajungeți aproape de un optim. În orice caz, acesta este aleatoriu. Dacă utilizați acum abordarea de programare pătratică, MOMA sau minimizarea ajustării metabolice. Acum obțineți rezultatul foarte interesant că acum devine din nou semnificativ statistic. Încă câteva valori aberante, 17 și 16 aici în magenta, și acestea sunt lucruri în care acum puteți face teste foarte specifice. Pentru că acum știți care sunt cele mai discrepante între fluxurile experimentale și cele prezise. Și puteți intra și întrebați ce parte a acelui model sau ce parte a acelei culegeri de date ar putea explica potrivirea slabă. Dar, în general, acest lucru începe să dea impresia că poate mutanții nu vor fi eligibili și că pot fi oarecum mai bine serviți de această soluție cvasi-non-optimă . Și dacă treci prin diferite condiții diferite cu diferite knockouts, poți vedea mai multe exemple în acest sens. Deci aici, în cadranul din stânga sus al Slide 59, unde avem condiția de limitare a carbonului în extrema stângă și apoi comparația metodei de echilibrare a fluxului pe tipul sălbatic. Iată acel coeficient de corelație de 0,9 și valoarea P bună și apoi comparăm MOMA și FBA. Și din nou, semnificația trecerii de la FBA la MoMA este de 3 ori 10 la minus 3, ceea ce indică faptul că programarea pătratică este aplicația mai potrivită aici. Și pe măsură ce parcurgeți acest lucru, veți vedea mulți coeficienți de corelație buni și multe îmbunătățiri când treceți la patratic sau MOMA, nu în toate cazurile, dar cu siguranță multe dintre ele. Acum, aceasta este o clasă de teste, care sunt fluxurile interne. Ideea este că ajustați fluxurile interne până când acestea sunt optime pentru a produce creștere. Ei bine, ce zici de măsurarea creșterii în sine pe un set de mutanți. Din nou, acești mutanți la care vă așteptați vor urma predicția MOMA puțin mai bine. Prin urmare, Slide 60 este o modalitate specială de a măsura un set mare de mutanți la nivelul genomului. Aceasta nu este o întreprindere banală. Știm cum să măsurăm un set de transcriptom de ARN. Unde pe microarrays, poate că există o modalitate analogă de a măsura genomurile în valoare de mutanți. În mod ideal, ai avea un mutant, nu doar unul pe genă. Un knockout per genă, care este poate o ștergere manuală foarte scumpă, dar ai avea o mică mutație țintită în fiecare domeniu care contribuie la acea funcție a genei. Mutații în elementele de reglare a ADN-ului , diferite domenii de proteine, domeniul de stabilitate a ARN și așa mai departe, nu chiar la acel nivel de ideal, dar apropiindu-se de el. Este mutageneza transpozonului, în care inserați mici bucăți de ADN aleatoriu în tot genomul. Setul modern de transpozoni utilizați în mod obișnuit este destul de aleatoriu în alegerea locului de inserare. Și apoi, aveți nevoie de o modalitate de a transforma această colecție de transpozoni într-o citire a ratelor de creștere. Ei bine, o modalitate de a face acest lucru este de a avea o populație de celule, fiecare având propriul transpozon distinctiv și creșterea lor ca un amestec. Și pe măsură ce cresc ca un amestec, cei care cresc mai bine vor domina populația. Și astfel transposonul lor a lovit joncțiunea dintre transpozon -- transpozonii sunt universali. Este prezent în fiecare celulă. Dar locul în care se află este unic pentru acea celulă, sau aproape. Deci se află în... joncțiunea dintre transpozon și genom este unică și vrei un mod de a testa asta. Felul în care testezi asta înseamnă că preiei ADN-ul complet din întregul amestec de celule și vrei să spui cât de mult există din fiecare transpozon? Deci tăiați întregul amestec de ADN cu o enzimă de restricție care taie frecvent. Așa-numitul cutter cu 4 tăieturi, tăie în medie la fiecare 236 de perechi de baze . Și vă place pe acest tip foarte special de linker, care este un linker care nu se va amplifica cu primerul corespunzător până când nu a trecut o altă sinteză a ADN-ului, deoarece vedeți că acest mic linker Y nu este perfect logic împerecheat . Este nevoie de ADN polimerază pentru a face un complement. Complementul va lega apoi primerul. Este un mod lung de a spune că numai în cazurile în care aveți un primer în transpozon lângă unul dintre acești linkeri Y veți obține amplificare. Transpozon singur, nu vei primi. Y linker singur, nu îl vei primi. Acesta este un pas de îmbogățire, iar motivul pentru care trebuie să vă îmbogățiți este că, dacă ați arunca toată chestia asta pe microarray, veți aprinde totul pentru că fiecare genom are fiecare parte din genom în el și transpozonii sunt prezenți în urme de cantități. Deci, trebuie să amplificați fragmentul de joncțiune mai întâi prin acest truc, urmat de un promotor T7. Acesta este un promotor de fagi foarte frecvent utilizat. Fundal de ARN polimerază foarte curat care a fost încorporat în orice transpozon de pe transposonul tău preferat. Deci acum aveți doi pași. În primul rând, această PCR mediată de ligatură și, în al doilea rând, transcripția T7 in vitro pentru a produce ARN. Acum, practic ați redus acest lucru la o problemă similară cu micromatricele transcriptomului pe care am făcut-o înainte. Acum ARN-urile sunt surogate pentru cantitatea fiecărei tulpini. Nu măsurăm ARN-ul. Am creat un ARN care reprezintă fragmentul de joncțiune a transpozonului și, prin urmare, vă permite să cuantificați cantitatea respectivului mutant într-o populație. Pe măsură ce acel mutant crește sau scade în populație, la fel crește și ARN-ul din acest test. Așa că ați putea întreba în acest moment, ei bine, acest lucru este grozav, dar nu am încredere. La fel cum unii oameni ar putea să nu fi crezut că spectrometria de masă este suficient de reproductibilă pentru a fi cantitativă. Deci, modul în care determinați dacă ceva este suficient de reproductibil pentru a fi cantitativ, o modalitate de a face acest lucru este să faceți două experimente de selecție independente . Evoluționistii ar putea spune, oh, dacă am relua evoluția din nou, nu am obține același set de organisme pe care îl avem astăzi pe Pământ. Poate fi adevărat, dar asta pentru că există tot felul de blocaje în evenimentele istorice. În acest caz, am încercat în mod special să-l facem reproductibil evitând blocajele, având fiecare mutație, fiecare tip de transpozon reprezentat de 1.000 de evenimente independente diferite. Precum și 1.000 de copii ale fiecărui transpozon lovit, astfel încât să păstrați dimensiunea populației mare și astfel devine mai reproductibilă. Și modul în care măsurați reproductibilitatea este să faceți cele două experimente de selecție. Cele două seturi ideal independente de transpozoni au fost supuse exact aceleiași proceduri de selecție. Și vedeți o curbă foarte îmbucurătoare aici cu o măsură de regresie R pătrat de peste 98%. Și genul de împrăștiere pe care ați fi încântat să o obțineți într-un experiment cu microarray ARN. Deci, acesta este reproductibil și, prin urmare, destul de capabil să producă date cantitative. Ei bine, acum să revenim și să comparăm cu cele două metode diferite de modelare a optimizării fluxului. Există FBA sau programarea liniară, care presupune că mutantul este imediat optim. Și apoi mai este MOMA sau minimizarea ajustării metabolice, care nu presupune oftalmologie imediată, ci presupune că este aproape de optimul sălbatic. Deci, începând de la partea de sus cu echilibrul fluxului liniar, puteți clasifica predicțiile modelului pentru fiecare genă. Și aici avem aproape 400-- aproape 500 de gene diferite mutate, și mai întâi parcurgeți predicțiile in silico, le puteți clasifica ca fiind esențiale pentru o anumită condiție de creștere. Ele nu sunt neapărat esențiale pentru fiecare condiție de creștere. Dar creșterea condiţionează aici esenţialul sau neesenţialul sau ceva la mijloc. Ne vom concentra doar pe extremele esențiale și neesențiale. Și apoi, experimentul poate fi clasificat dacă există o selecție negativă semnificativă sau nicio selecție vizibilă în anumite condiții de creștere. Așadar, vă așteptați ca cele care sunt esențiale în aceste condiții de creștere să fie puternic negative în mod selectiv și aveți 80 de exemple din 142 prezise. Cu toate acestea, nu v-ați aștepta să lipsească vreunul în selecție, deoarece sunt esențiale. Deci 62 ar trebui să fie un zero pentru 62. Acesta este un exemplu despre modul în care vom încerca să explicăm sau să folosim acest lucru ca o modalitate de a genera ipoteze interesante despre excepții sau valori aberante. În mod similar, genele neesențiale nu ar trebui să aibă selecție. Acest 180 în partea din dreapta jos a FBA de sus, dar 119 ar trebui să fie zero. Deci prima explicație a trecerii este OK. Știam că acestea nu vor fi optime imediat. Deci, să folosim celălalt model, modelul sub-optim, aproape optim MOMA și să vedem cât de bine se descurcă. Ei bine, în partea dreaptă a Diapozitivului 62, vedeți că valoarea P chi-pătrat este cât de bine sunt de acord predicțiile cu observațiile. Și este semnificativ pentru programarea liniară. Este de 4 ori 10, apoi minus 3, destul de semnificativ. Și MOMA este mult mai semnificativ decât minus 5. A îmbunătățit unele dintre cele 66 din dreapta sus și 108 din stânga jos. Acestea ar trebui să fie în continuare zero și nu sunt. Și măsura în care se abat de la așteptarea ideală înseamnă că fie datele -- sau cumva modul în care colectăm datele nu așa cum ne așteptam. Sau că modelul, mai probabil că modelul are unele probleme în el. Și exemple de probleme pentru acele două clase, genele esențiale prezise care arată acelea-- care nu prezintă selecție, ar putea fi exemple de redundanțe pe care nu am reușit să le modelăm când am pus împreună matricea stoichiometrică. Matricea stoichiometrică luăm fiecare reacție biochimică cunoscută. Am putea lua omologii convingătoare la nivel de omologie secvențială și să spunem că acestea ar putea fi exemple de redundanță. Am putea lua rădăcini analoge sau paralele care sunt cunoscute documentate biochimic, unde puteți ajunge la același punct printr-o serie de pași enzimatici omologi, eventual non-secvenți . Deci sunt concedieri noi. Acesta este un exemplu de descoperire potențială și poate fi urmărit într- un mod foarte direcționat, deoarece acestea sunt 66 de predicții foarte specifice. 108 knockout-uri esențiale ale genelor , care arată totuși selecție negativă, ar putea fi exemple de efecte de poziție. În cazul în care o mutație într-o genă afectează alte gene care sunt apropiate de-a lungul poziției ADN-ului, adică de-a lungul ADN-ului, un exemplu în acest sens este că o varietate de mutații într-o genă care se află în amonte de o altă genă dintr-un operon, au efecte mai slabe asupra avalului. gene datorită cuplării transcripţiei şi translaţiei. Puteți avea și alte efecte de poziție. Acestea sunt exemple de posibil multe explicații și descoperiri care pot contribui la natura minunată a... este o situație de câștig pentru toate. Fie obțineți o corelație excelentă, fie obțineți excepții și descoperiri grozave, sau ambele. OK, acum, când am vorbit despre redundanță ca una dintre posibilele explicații din diapozitivul anterior, asta aduce în discuție o componentă conceptuală cu adevărat importantă a lumii genomicei funcționale post-genomice. Ce facem cu mai multe domenii omoloage? Când treci prin și secvențiază genomurile, găsești paralele. Găsești fie gene întregi, fie bucăți de gene care au omologie de secvență mare, despre care am vorbit la începutul cursului. Și iată exemple de trei regiuni care codifică proteine. Codificăm enzimele implicate în biosinteza aminoacizilor. Așa că vă puteți imagina că atunci când creșteți celulele pe medii minime, nu furnizați aminoacizii, deci celula trebuie să producă aminoacizii. Dacă are o mutație, un transpozon a lovit una dintre aceste gene, care este cheia în sinteza de biosinteză a lizinei 3 și a metioninei. Și te-ai putea aștepta să nu crească bine. Va fi într-un dezavantaj selectiv în mediile minime, cu excepția cazului în care una dintre celelalte gene o acoperă. La fel de posibil ca verde-- deci acestea au două sau trei domenii aici codate cu culori. Deci domeniul verde este împărtășit de aceste trei proteine ​​biosintetice, care de altfel sunt foarte diferite în contribuțiile lor metabolice. Și vă puteți imagina că unele dintre aceste domenii verzi ar putea acoperi altele atunci când unul dintre ele este mutat. Unul dintre ei, totuși, cel din lizină, când a primit o lovitură de transpozon în acel domeniu, dezavantajul selectiv al ratei de replicare în medii minime este sever. Este un fapt. Este un ordin de mărime, în timp ce celelalte sunt mai subtile. S- ar putea ca lizina să acopere celelalte două pentru că este făcută în cantități mari, să fie foarte activă. Dar celelalte două nu pot acoperi lizina, sau există o varietate de alte explicații posibile pentru această observație. Ideea este că acest lucru generează ipoteze care ne permit să urmărim echilibrul fluxului sau modelarea de tip MOMA. Și cred că motivul pentru care am petrecut atât de mult timp este că conceptul de optimizare este ceva important atât în ​​sensul că suntem în inginerie, cât și ca ingineri, optimizăm sistemele vii. Și, de asemenea, ca studenți ai sistemelor evolutive unde să înțelegem pentru ce sunt optimizate acele sisteme, trebuie să privim din această perspectivă. Deci asta este exact ceea ce am tratat astăzi. Am acoperit atât modalități continue, cât și discrete de modelare a sistemelor moleculare. Și, în special, controlul celulelor roșii din sânge și al numărului de copii , ca o modalitate de a trata metabolismul și biopolimerii separat, iar echilibrul fluxului le- a reunit și a adus noțiunea de optimizare. OK, deci până data viitoare.