ZOLTAN SZALLASI: -tehnologii.
Și acesta este un fel de
diapozitiv introductiv.
Ai auzit multe de la Zack.
Cred că asta a fost ultima
dată, acum o săptămână
sau acum două săptămâni despre
tehnologia microarray.
Și sunt sigur că a
ținut o discuție extrem de
inspirată și entuziastă
despre posibilitățile
și domeniul de aplicare a acestei tehnologii.
Dar lasă-mă să-ți spun
doar puțin această linie.
Deci, ori de câte ori apare o nouă
tehnologie
sau, de exemplu,
tehnologia microarray sau
Proiectul Genome, desigur, mai întâi,
există o exuberență generală
și un optimism că toate
problemele vor fi rezolvate
în câțiva ani.
Există o mulțime de motive
pentru acest optimism.
Una este că vrei
investitori în companie
și vrei finanțare publică.
Dar, desigur, în
câteva luni sau ani,

încep să apară așteptări realiste.
Și apoi trebuie să începeți
să vă gândiți la limitările
tehnologiei actuale.
Și de fapt, acesta este
motivul pentru care avem
o discuție despre acest subiect.
Așadar, când vorbim despre
limitările tehnologiei,
trebuie să definim ce
vrei de fapt să faci în știință.
Desigur, există o mulțime de
definiții diferite ale științei.
Dar, într-un fel, ați
dori să faceți predicții
despre o parte dintr-un sistem.
Și vom vorbi despre
limitări în acești termeni.
Cum îți va limita
puterea de predicție?
Deci, atunci când vorbiți
despre limitări,
puteți vorbi despre cât de
precisă este măsurarea dvs.
Există limitări
ale preciziei,
ale măsurătorilor,
preciziei și zgomotului.
Dar există limitări
în ceea ce privește sensibilitatea.  Ce
masori.
Cât de completă este
măsurarea ta?
Și, desigur, voi
aborda pe scurt acest lucru,
că, chiar dacă măsurați
totul foarte precis,
există limitări inerente
în puterea dumneavoastră de predicție.  Nu
poți prezice totul.
Gândiți-vă la imprevizibilitate
în termeni de haos.
Chiar dacă măsurați
totul foarte precis,
există sisteme pe care
pur și simplu nu le puteți prezice cum se va
comporta
într-un mod analitic.
Deci, zgomot-- mai întâi, aș
dori să definesc ce este zgomot
și ce este semnal.
Zgomotul este o
caracteristică inerentă a sistemelor complexe.
Și zgomotul în măsurători continue și
discrete, zgomotul
este limitările
tehnologiei.
Și, bineînțeles, trebuie
să vorbim despre ce se
poate face în privința zgomotului.

Pentru asta a fost inventată statistica.
Și voi vorbi
pe scurt despre normalizare.
Deci, ce este zgomotul?
Există definiții diferite.
Asta, desigur, am
luat-o de la Webster.
Și să ne
uităm doar la acest punct
D, care este „o ieșire de
date irelevantă sau lipsită de sens
, care apare împreună
cu informațiile dorite”.
Acum ar trebui să fiți conștienți de faptul
că zgomotul nu este întotdeauna
un lucru rău.
Uneori zgomotul se poate dovedi
a fi un semnal foarte important.
Și care este trecutul tău?
Sunt doar...
PUBLIC: Biologie.
ZOLTAN SZALLASI: Biologie.  Îmi
pare rău?
PUBLIC: Medicină.
ZOLTAN SZALLASI: Medicină, OK--
deci probabil că acesta nu este cel
mai bun exemplu pentru tine.
Dar au fost doi tipi,
doi astronomi radiali, cu
mulți, mulți ani în urmă.
Cred că asta a fost
acum aproape 50 de ani,
cei care căutau semnale.
Și tocmai au văzut
acest zgomot venind
din toate direcțiile
universului ca astronomi radiali.
Și aceasta s-a dovedit a
fi radiația cosmică de fond
, care este una dintre cele
mai importante descoperiri.
Și tipii ăștia care
au primit de fapt Premiul Nobel
câțiva ani mai târziu.
Asta a început cu zgomot pur.
Și încercau să
scape de acel zgomot.
Nu puteau.
Și asta a condus la descoperirea
radiației cosmice de fond.
Dar dacă te gândești la
medicină, de exemplu,
la felul în care cisplatină a fost descoperită
ca agent chimioterapeutic,
ceea ce s-a întâmplat este
că electrozii pe care i-au
folosit în acele
experimente conțineau platină.
Și au văzut efectul... să
intri.
Oh, vei petrece timpul
, OK.
De fapt, am vrut doar
să închid ușa
pentru că știu că e enervant.
Și apoi au
încercat să descopere
ce ucide celulele, ce
încetinește creșterea.
Și apoi și-au dat seama
că, de fapt,
era platina care conține
acei electrozi.
Și acesta este modul în care au
descoperit această platină.
Deci ideea este că zgomotul
nu este întotdeauna un lucru rău.
Acum, ce se întâmplă dacă vedeți ca zgomot
sau eroare în măsurători,
în măsurătorile biologice,
ar putea fi o componentă cheie
a proceselor biologice.
Deci, desigur,
mutațiile în evoluție
sunt extrem de importante.
Și când vom vorbi despre
măsurători discrete, o formă
a acesteia este, de fapt,
atunci când secvențiezi,
vei vedea mult zgomot
în lumea umană,
tot felul de genomi.  Asta se
numește ADN nedorit.  Ei
bine, nu știm cu adevărat
pentru ce este acest ADN nedorit.
Atunci... nu, mergi înainte.
Acolo.
PUBLIC: Îmi pare rău.
ZOLTAN SZALLASI: Ar fi trebuit să
spun, haide.
Este încă introducerea.
Așa că nu
urmărim cu adevărat acest ADN nedorit
atunci când încercați să găsiți
gene sau exoni ai intronilor
sau ai
site-ului de legare a factorului de transcripție.
Și asta te
va deranja
foarte mult atunci când
încerci să găsești aceste
semnale adevărate în genom.
Nu știm cu adevărat la ce
servește ADN-ul nedorit.
Dar ar putea exista un
motiv bun pentru care există.  Ar
putea fi determinarea
distanței spațiale
a diferitelor gene sau altceva.  Un
alt tip de zgomot care
pare a fi foarte important
este în timpul diferențierii.
Foarte des, vedeți o
diviziune celulară asimetrică.
Deci ARN-ul sau proteinele sunt împărțite
sau distribuite între cele două
celule fiice în mod asimetric.
Și asta se face de fapt
sau se întâmplă mai mult sau mai puțin
întâmplător.
Și cele două fiice
vor merge într-un fel sau altul,
în funcție de cât de mult
ARN sau proteină au primit.
Acest lucru, puteți
percepe ca
o măsură de zgomot dacă
faceți o măsurătoare cu o singură celulă.
Iar fluctuațiile stocastice
pot fi foarte importante
pentru stabilitatea
sistemelor fizico-chimice complexe.  S-
ar putea să vorbesc despre
rețele genetice stocastice
și robustețe mult
mai târziu în aprilie, când
vorbim despre modelare.
Și să ne fie suficient acum, că
stocasticitatea și zgomotul
în sistemele complexe ar putea
fi o caracteristică foarte importantă
pentru a menține
stabilitatea acelui sistem.  Ar trebui să
știți,
desigur, că rețelele genetice
și sistemele biologice
sau sistemele stocastice,
pentru că știți că, de
exemplu, aveți doar câteva
100 de copii ale unui
anumit
factor de transcripție pe nucleu sau chiar
mai puțin, uneori aveți doar 50 de copii.
pe nucleu.
Mediul intracelular
nu este o soluție gratuită.
Și
cinetica reacției este adesea lentă.
Și ceea ce înseamnă este că, dacă
aveți un sistem stocastic
în acest caz, că dacă aveți
un sistem complet determinist
, atunci de la orice expresie genică dată
găsită în orice
stare dată, puteți merge într-o
stare, într-o altă stare.
Acesta este un sistem determinist.
În timp ce într-un
sistem stocastic, din orice stare dată,
puteți merge în diferite
stări cu o
anumită probabilitate.
Deci, asta înțelegem
prin sisteme stocastice.
Acum, dacă ai asta, ai
un sistem stocastic în biologie.
Apoi, atunci când măsurați
nivelurile de expresie a genelor sau
nivelurile de expresie a proteinelor
sau orice activitate
a oricăror
parametri biologici,
veți percepe asta ca un
zgomot în măsurarea dumneavoastră.
Acum este adevărat?
Sau este cu adevărat
relevant pentru biologie faptul
că aveți stocasticitate
prezentă în sistem?
Și aceasta a fost o lucrare care a
apărut acum, acum aproape doi ani.
Dar, de fapt, au
vrut să măsoare acest lucru.
Acest lucru a fost făcut în bacterii,
dar recent, studii similare
au fost publicate și în drojdie.
Și ce au făcut, au luat
două proteine ​​din E coli.
Și au pus un verde,
două GFP diferite, două proteine ​​fluorescente
verzi diferite,

astfel încât să poată măsura

nivelul de expresie a două proteine.
Și au configurat
sistemul într-un mod în
care, dacă era
determinist, atunci
era sub
același promotor.
Ambele gene au fost
exprimate sau conduse
de același promotor.
Și a fost un
experiment de configurare foarte atent.
Deci, dacă sistemul
era determinist,
atunci la ce se așteptau ei ca
raportul de expresie al acestor două
proteine ​​va fi
același în fiecare celulă.
Acum, ceea ce au descoperit, că,
în ciuda tuturor eforturilor lor
de a configura experimentul
cât mai perfect posibil,
au descoperit că două
culori diferite.
Asta înseamnă că aici
este roșu și verde.
Dar, desigur, acestea
sunt doar colorări false.
Ideea este că aveți două
lungimi de undă diferite în care
sunt emise aceste semnale.
În funcție de
celula reală,
puteți avea celule foarte verzi,
foarte roșii și unele galbene
, ceea ce înseamnă
că, în ciuda modului atent
al acestui sistem al acestui
experiment,
aceste celule au exprimat cele două
proteine ​​într-un raport diferit.
Și asta s-a datorat
stocasticității.
Deci, ideea este că
fluctuațiile stocastice
apar în organismele vii.
Ei încearcă să
înțeleagă, acum destul de greu,
care este relevanța acestui lucru.  Se
pare că are
multă relevanță.
Dar, desigur, nu suntem foarte
siguri care sunt implicațiile.
- Trebuie să știți
că, ori de câte ori
faceți o măsurătoare biologică,
sau ceea ce
ar putea dezvolta tehnologia în zilele noastre,
măsurați întotdeauna
datele medii ale populației.
Deci, asta din nou, se va
adăuga la zgomotul tău.
Când măsurați
nivelurile de expresie a genelor
sau faceți proteomică,
desigur, veți
măcina milioane de celule
sau zeci de mii de celule.
Și asta
vă va oferi și un anumit nivel de zgomot
.
Și acest lucru este chiar
adevărat, acest lucru este adevărat
chiar dacă celulele individuale
sunt cuantificate.
Motivul este că, dacă
aveți o rețea stocastică,
și să ne imaginăm
că puteți
măsura cu adevărat nivelurile de expresie a genelor.
Puteți face acest lucru,
desigur, pentru proteine ​​individuale
în celule individuale.
Dar ori de câte ori încă îți
faci măsurarea,
de obicei interferezi
cu celula.
Sau ucizi celula.
Deci nu
știi cu adevărat cum ar fi
progresat acea celulă.
Deci, din moment ce ați interferat
cu sistemul
și încă aveți
sistemul, nu vă puteți da seama cu adevărat
ce s-ar fi
întâmplat în sistem.
Deci, veți
ajunge din nou cu o
medie a populației.
Deci nu există
măsurători fără zgomot.
După cum știți, este de obicei
acuratețea, sensibilitatea
măsurătorii dvs.
Și sunt sigur că majoritatea dintre voi
ați fi extrem de tulburați
dacă ați face o
măsurătoare cu microarray sau o parte
dintr-o măsurătoare chimică sau
biologică
și, în trei exemplare,
ați obține exact
același număr.
Asta ar însemna
probabil, pentru cei mai mulți dintre voi,
că există
o eroare sistematică
în ceea ce faceți la
fotometrul dvs. sau altceva.
Pentru că te-ai
aștepta la o răspândire
a datelor tale continue.
Deci este de așteptat ca
variabilele continue
să aibă date cu
o anumită răspândire.
Și asta e în regulă.
Și de aceea a
fost inventată statistica.
Dar știi că
există o parte dintr-o valoare adevărată
a măsurătorii tale.
Dar din cauza micilor
fluctuații,
aveți o anumită răspândire
în jurul acesteia prin variabilă.
Și, desigur, de obicei
întrebarea este--
și asta este cea mai bună
statistică la această frecvență

cu care se păstrează statisticile,
că aceasta este o schimbare variabilă datorată
unui tratament dat ori de câte ori
aveți o răspândire ca asta.
Deci, dacă aveți măsurători
aici sau aici sau aici
și acesta este punctul dvs. de plecare
, atunci care este
probabilitatea ca
parametrul dvs. să-și
schimbe cu adevărat valoarea?
Deci, ceea ce trebuie să faceți pentru
aceasta este să aveți, desigur, o
mulțime de măsurători
și/sau o idee destul de bună
despre natura zgomotului.
Și asta este foarte important.
Nu vom
intra în asta acum.
Dar, după cum știți,
că, de exemplu, cea
mai ușoară sau cea mai
convenabilă presupunere
este că aveți o
distribuție normală.
E bine să ai asta.
Pentru că dacă
aveți asta, atunci
puteți face
calcule foarte simple
cu privire la probabilitatea
ca dacă media dvs.
sau dacă parametrul dvs.
este de fapt schimbat sau nu.
Deci statistica a fost
inventată cu mult timp în urmă.
Și de fapt, parțial, s-a
datorat măsurătorilor biologice.
Și astfel statistica este
preocupată în biologie
de multe, multe
probleme diferite.
Una dintre ele este care este
valoarea adevărată a unui parametru dat
dacă există o singură valoare adevărată?
Există o
analiză foarte frecvent utilizată de
care oamenii sau biologii
nu sunt cu adevărat conștienți, care
este un fel de analiză bayesiană.
Și de fapt, aceasta este cea
mai frecventă
analiză statistică făcută
în biologie, acesta
este modul în care funcționează toată știința.
Am o convingere similară
dacă se
va întâmpla ceva sau,
de exemplu, o oncogenă
va transforma
sau nu o celulă.
fac o declarație.
Și treaba mea este,
de fapt, să te conving pe
tine sau pe alți biologi
că acest lucru este de fapt adevărat.
Acum, ceea ce poți face,
ceea ce faci de obicei,
este să
repeți experimentul.
Și dacă vedeți
același fenomen,
atunci vă
actualizați într-un fel -
veți actualiza
credința noastră comună că ceea ce
spuneam eu este de fapt adevărat.
Deci, statistica bayesiană
este întotdeauna acolo
într-un mod ascuns în toată biologia.
Încercăm să ne actualizăm
reciproc
rețeaua de credințe în ceea ce privește biologia.
Al treilea tip de
analiză statistică
este că nu prea
crezi măsurătorile.
Dar știți că există
unele erori sistematice acolo.
Și apoi încerci să corectezi
această eroare sistematică
și asta se
numește normalizare.
Și voi vorbi
despre asta în detaliu acolo.
Și există o a patra
problemă în statistici
când produci de fapt o
mulțime de, o mulțime de măsurători.
Cauți
anumite modele.
Imaginați-vă că căutați
modificări ale expresiei genelor care
vor provoca cancer.
Și aveți două populații
de mostre, normale
și canceroase.
Și vezi că
anumite tipuri de gene
sunt întotdeauna subreglate
sau suprareglate sau mutate
în cancer.
Acum asta s-ar putea întâmpla întâmplător.
Dacă nu aveți un
număr mare de eșantioane
și această schimbare este
de fapt pur și simplu aleatorie --
deci, în anumite celule, este până.
În alte celule, este în jos.
Atunci, dacă aveți un
număr greșit de mostre,
atunci s-ar putea întâmpla
ca doar întâmplător,
cu o anumită probabilitate,
în toate probele normale,
acea mutație să nu fie prezentă.
Și în toate
mostrele de boală sau de cancer, va
fi prezent.
Deci, ceea ce trebuie să întrebi
este acel model, care
ar explica ca biologia ta
să fie prezentă întâmplător?
Și astfel de
numere sunt prea multe.
Și ceea ce poți
face este de fapt că
poți încerca să rezolvi
analitic, despre asta
este combinatoria.
Sau poți face
unele permutări.
Și după cum veți vedea mai târziu, aceasta este
de fapt o problemă destul de urâtă
atunci când încercați să
o aplicați pentru probleme din viața reală.
Deci măsurătorile biologice
sunt adesea costisitoare.
Și ceva ce aș dori
să vă subliniez,
că dacă urmați
literatura
sau când veți începe
să citiți literatura --
și presupun că o veți face pentru că de aceea

urmați acest curs.
Veți vedea o mulțime de articole despre
știința naturii și lucrări de mare profil
, în care au
efectuat o singură
măsurătoare cu microarray pe un număr mare
de mostre diferite de cancer.
Și apoi
trag tot

felul de concluzii
despre care gene sunt importante
pentru cancer, care nu este.
Și aceste măsurători au
fost încă destul de scumpe.
Și nu este ușor să veniți, nu este
ușor să obțineți mostrele.
Dar ar trebui să fii conștient de faptul
că nu poți face nicio
statistică în acest sens.  Ar
trebui să faci un fel
de statistică bayesiană.
Dar orice ar face ei în legătură cu
asta nu este cu adevărat statistică.
Va fi bayesian.
Aveam să spun că
văd această schimbare foarte des
și ori
crezi sau nu.
Dar nu puteți obține cu adevărat
cifre hardcore pe
care să le folosiți pentru
orice analiză statistică
sau modelare.
Deci numere de încredere nu pot fi
produse fără replici,
ceea ce este cam evident.
Deci, problema centrală este
că în măsurătorile biologice masive
,
apelurile cantitative și calitative
ar trebui să fie
făcute pe un număr mare
de variabile eterogene,
folosind doar câteva replici.
Asta veți
vedea din nou și din nou
dacă lucrați la scară mare
sau la biologie masiv paralelă.
Și aceasta este una dintre
problemele pe care tehnologia
și analiza
trebuie să le depășească.
Deci, de unde
provine zgomotul
în măsurătorile cu microarray?
Deci acesta este un diapozitiv, cred că ați
văzut câteva variante
ale acestui lucru în discursul lui Zack.
Deci, așa
funcționează un cip de microarray ADN Afymetrix.
Deci începi cu țesutul
și extragi ARN.
Și ceea ce faceți este
să faceți un RT, un tratament cu
transcriptază inversă
sau să pășiți
pe el, care va traduce
înapoi ARN-ul în cADN.
Și, în funcție de
modul în care o faci,
poți produce fie ADNc, fie CRNA.
Deoarece în timpul acestui
proces, când produceți

ADNc sau CRNA,
coloranții fluorescenți vor fi
încorporați în polimeri.
Și apoi acestea
vor fi hibridizate
cu sondele specifice
prezente pe cip.
Acum,
ipoteza sau așteptarea de bază
este că, în mod ideal, o
copie a unui ARN dat
va produce o unitate
a unui semnal specific.
Dacă acest lucru ar fi adevărat,
atunci ai avea
măsurători foarte precise.
Dar acum să vedem ce se
întâmplă de fapt în realitate.
Când ADNc este produs
din ARN folosind RT,
aceasta este o enzimă
care are propria viață,
propriile sale caracteristici.
Deci inițierea
etapei RT este stocastică.
Pentru că sunt sigur că
știți asta,
aveți nevoie de un
primer de pornire care va
fi extins de
revers transcriptază.
Și foarte des,
reversul transcriptaza,
enzima pur și simplu scade.
Deci, de aceea, ceea ce
vedeți este, de fapt,
când faceți o
măsurătoare cu microarray,
vedeți de obicei un semnal mult mai puternic,
cele trei provenind
de la capătul 3-prim al
genei decât de la capătul 6-prim.
Pentru că pe măsură ce transcrieți
și transcrieți invers
mesajul, RT
începe să cadă.
Deci, aveți întotdeauna un
semnal mult mai puternic
de unde este pornit RT,
care este întotdeauna RT
pentru că acolo--
ceea ce utilizați de obicei
este un poli(A).
Folosești eticheta poli(A)
ca inițiator.
Puteți folosi
și grunduri aleatoriu.
Și de fapt, uneori, este
folosit pentru unele în bacterii.
Dar de cele mai multe ori
începi cu poli(A).
De asemenea, cARN, care este utilizat
pentru cipul affymetrix,
este produs în prezența
coloranților fluorescenți.
Și se presupune că
încorporarea colorantului.
Sau sa sperat sau se
speră că încorporarea colorantului
va fi liniară.
Și va
fi încorporat
cu aceeași probabilitate.
Dar nu este cazul.
Producția de ARNc
nu este liniară.
Există mesaje care
sunt transcrise în cARN
cu o probabilitate mult mai mare, cu
eficiență mult mai mare
decât altele.
Și nici încorporarea colorantului
nu este liniară.
De asemenea,
cip-ul affymetrix implică un pas
și chiar îți
distrugi cARN-ul.
Indiferent de motiv,
acesta este designul chipului.
Și descompunerea
ARNc-ului în bucăți mici
nu va fi aceeași
nici pentru toate mesajele.
Și, desigur,
aveți tot felul
de alte probleme,
cum ar fi hibridizarea
sau hibridizarea încrucișată.
Și se poate continua
și mai departe și ceea ce
ți-ar da zgomotul este
doar câteva mostre.
Dar ideea este că
semnalul tău final
va fi
suma tuturor celor de
mai sus, sau toate aceste
lucruri și altele.
Așadar, acesta este doar o
idee
despre câte
probleme individuale vor apărea atunci când
efectuați o micromăsurare.
Desigur,
chimia suprafeței este foarte importantă,

scăderea fondului și așa mai departe.
Deci, să vedem un alt exemplu.
Acesta este
microarrayul cu două culori.  Cel
precedent, cu
cipul affymetrix,
ați auzit ultima oară, în
care de fapt
scoateți un singur cARN per cip.
Și a existat o altă
tehnologie concurentă
inventată în același timp.
Când etichetați de fapt ADNc
a două mostre diferite,
măsurați două mostre
și de fapt
măsurați raportul
pentru fiecare genă individuală.
Deci, în acest caz, ceea ce
faceți este să aveți cantități egale
de probe de ADNc etichetate.
Și ceea ce speri, ceea ce
încerci să obții
este că, dacă un anumit mesaj
este prezent la același nivel
în ambele probe, atunci
cele două intensități,
semnalele
vor fi egale.
Deci vei avea un
fel de pată roșie, galbenă
dacă o genă este supraexprimată
sau subexprimată,
vei avea o
culoare roșie sau verde mai puternică.
Acum ceea ce ajungi
la aceste măsurători
este un raport.
Și problema este
că, de fapt,
nu există un loc gol cu ​​adevărat.
Întotdeauna aveți un fel
de zgomot de fundal acolo.
Și tu măsori raportul.
Apoi, bineînțeles,
acel punct neblank
vă va da un
fel de pseudo-semnal fals.
Deci, dacă sunteți, de
exemplu, dacă
există o genă care nu este prezentă
deloc într-o probă dată
și este exprimată
în celălalt eșantion,
atunci raportul ar fi,
desigur, infinit de mare.
Sau ar fi foarte,
foarte, foarte mare.
Dar nu vezi niciodată asta.
Întotdeauna ai, din moment ce ai
o anumită intensitate de fundal,
ceea ce vezi este un
fel de, să spunem, o
reglare în sus de 100 de ori, care
de fapt, sau într-adevăr,
ar putea fi o
reglare completă în jos
sau o lipsă completă a acelei
gene.  într-una dintre probe.
Deci, acest lucru este perceput
de experimentator
ca comprimarea semnalelor.
Deci, aveți o dinamică foarte largă
a rapoartelor,
de la minus infinit
la plus infinit,
dar ceea ce vedeți de fapt -
și acest lucru este foarte de obicei,
majoritatea acestor măsurători
sunt, rapoartele sunt tăiate -
este de 100 de ori în sus-  sau
down-regulation de ambele părți.
Există o mulțime de
probleme experimentale
care pot contribui și
la zgomotul [INAUDIBIL].
Deci, așa este
proiectat cipul Affymetrix.  Ai mai
văzut asta înainte.
Și ceea ce aveți, deci acestea
sunt sonde foarte scurte...
sonde de 25 de perechi de baze.
Modul în care Affymetrix a încercat
să depășească această problemă
este că au proiectat
un set de sonde de-a
lungul unei anumite gene folosind
un fel de algoritm.
Și ce au sperat ei
pentru asta, dacă
aveți o mulțime, și o mulțime,
și o mulțime de sonde--
11 sau 16 sonde per genă--
atunci din acest
set de sonde,
puteți estima cumva
nivelul adevărat de expresie a genei.
Deci, așa
proiectează de fapt.
După cum vedeți aici, aceasta
este întreaga genă,
iar gena este împărțită
în
regiuni suficient de unice ale genelor.
Acum, problema aici vine
de la măsurarea reală,
că acestea de aici sunt
sondele perfecte cu plasă care ar
trebui să măsoare același g.
Într-o oarecare măsură, te-ai
aștepta ca toate aceste
niveluri de expresie, toate aceste
intensități, să fie egale.
Și foarte des, pentru majoritatea
genelor, pentru majoritatea scopurilor,
acesta nu este cazul.
Ai sonde foarte luminoase
și foarte întunecate.
Există o mulțime de
motive pentru asta.
Aveți
structură secundară cARN
și așa mai departe.
Dar ideea este că, atunci când
te uiți puțin mai amănunțit,
mai profund, la ceea ce
obții de fapt
din aceste
măsurători, ei bine, se
așteaptă să estimi
adevăratul nivel de expresie a genelor
din acest
set de intensități
care pot varia adesea cu patru
sau  cinci ordine de mărime.
Așa
funcționează realitatea, aceste experimente.
Deci, aceasta este doar o altă
informație suplimentară
că nu este atât de
ușor să proiectați asta.
Dar, bineînțeles, se
poate îmbunătăți mult,
iar domnul care stă
aici îți poate spune o
mulțime de povești interesante
despre cum sunt proiectate aceste lucruri
sau cum nu sunt
proiectate de producător.
Dar asta e povestea.
Așa că încercam doar să
vă dau câteva gânduri,
câteva
date, despre de unde
provine zgomotul
în
măsurătorile Affymetrix în viața reală.
Dar chiar dacă ai avut
măsurători de foarte bună calitate,
ai
și alte probleme conceptuale în acest domeniu.
Deci, să presupunem că doriți
să folosiți numerele pentru a face
inginerie inversă a unui sistem
sau pentru a face
modelare directă, mai multă
simulare directă,
rețele genetice mari.
Dar ai vrea să ai
numere de foarte bună calitate.
Problema este că atunci când faci
aceste măsurători,
măsori întotdeauna o soluție foarte eterogenă
, o
populație foarte eterogenă
de ARN și proteine.
Acum, când ați început această
măsurătoare, cum vă veți
normaliza numerele?
Deci, cum vă exprimați
măsurătorile,
chiar dacă măsurarea dvs.,
tehnologia dvs. este foarte bună?
Per unitate de ARN?
Per microgram ARN?
Problema cu aceasta este
că dacă aveți o scădere a
nivelului unei anumite gene -
și unele gene sunt
foarte puternic exprimate -
și atunci mesajul
altor gene,
inevitabil, este
creșterea relativă
a nivelului altor mesaje.
Pentru că să presupunem că aveți
un milion de copii, sau să
spunem 10 milioane de copii
pentru ARN per celulă.
Deci, dacă o genă foarte exprimată
este reglată în jos,
atunci ceea ce percepeți
în măsurarea dvs. este --
cu excepția cazului în care încercați de fapt
să normalizați pentru numerele reale de copii -
că unele dintre gene
sunt ușor reglate.
Deci, există și alte
probleme conceptuale
de ce vei avea
zgomot în măsurarea ta.
Dar, așa cum am menționat,
adevărata problemă
este că problema reală este
tehnologia reală.
Acum, ceea ce puteți
face cu asta este că,
atunci când aveți un set
de măsurători,
doriți să aruncați o
privire atentă asupra datelor dvs.
pentru a vedea dacă aveți un
fel de eroare sistematică
în măsurare.
Acestea sunt o grămadă de
măsurători Affymetrix -- viața reală,
măsurători reale --
în care ceea ce vedeți
este distribuția intensității
tuturor seturi de sonde.
Deci ceea ce aveți aici este
măsurarea, măsurătorile expresiei genelor
pe aproximativ 10,
11.000 de gene diferite,
toate acoperite de un
set diferit de sonde.
Și asta este ceea ce
vedeți ca o distribuție.
Acum, ceea ce vedeți
aici este că există
o măsurătoare care este
foarte puternic aberantă,
și încă o altă măsură.
Acestea sunt cam la fel.
Și imaginați-vă că de fapt
rulați același eșantion.  Să
presupunem că aveți
o singură linie celulară
și o tratați
cu diferite medicamente.
Acum, ceea ce te-ai
aștepta este în esență
aceeași distribuție
pentru fiecare dintre aceste mostre de ARN,
cu câteva diferențe,
câteva variații.
Și îl ai pe tipul ăsta aici.
Deci, ceea ce puteți presupune -
și asta este de fapt ceea ce
fac oamenii și algoritmul Affymetrix --
că, dintr-un motiv oarecare,
în timpul acestei măsurători,

încorporarea colorantului fluorescent
nu a fost la fel de eficientă, sau
cititorul dvs. fluorescent
a fost calibrat greșit,
sau altceva,
dar a apărut o eroare sistematică.
Deci, ceea ce presupuneți
este că distribuția
pentru toate aceste măsuri
este de fapt aceeași.
Deci, ceea ce puteți face este să
începeți să vă schimbați curbele,
pentru că aveți un
motiv întemeiat să presupuneți
că acestea sunt de fapt toate
distribuții foarte asemănătoare.
Deci, ceea ce puteți face
este să luați de fapt
media sau mediana
tuturor acestor curbe
și să le mutați la
aceeași medie sau mediană.
Și pur și simplu
decideți unde
veți muta totul în rest.
Și apoi, pe baza asta,
renormalizezi toate numerele.
Și când cauți
gene exprimate diferențiabile,
lucrezi cu acele
numere renormalizate.
Pentru că dacă nu ai făcut-o,
dacă nu ai fi făcut asta,
atunci ai spune că fiecare
genă este reglată în jos,
ceea ce este evident fals.
Deci
despre asta este normalizarea.
Așadar, normalizarea, în general,
este că nu
crezi cu adevărat numerele care
ies din experimentele tale
și speri sau
presupui că
vei îmbunătăți efectiv
acele numere presupunând
că ai o
eroare sistematică pe care o poți  corect.
Există două moduri
de a face acest lucru.
Una este că presupui
că majoritatea sau anumite lucruri
nu se schimbă,
iar a doua
este că, de fapt,
ai un model de eroare.
Deci, primul este să
presupuneți că majoritatea
sunt anumite lucruri care
sunt modificări față de ceea ce ați
văzut în diapozitivul anterior.
Deci spuneți că majoritatea
acestor distribuții
trebuie să fie
foarte, foarte asemănătoare.
Și puteți modela mediile
sau medianele acestor curbe,
dar uneori și
forma curbei
va fi
diferită.
Și, ei bine, dacă
aveți această neliniaritate
a încorporării matriței, atunci
nu presupuneți doar că --
puteți presupune că, dacă
curba este deplasată,
atunci forma
curbei va
fi și [INAUDIBILĂ].
Deci poți face ceva
[INAUDIBIL] [?  cel mai jos, ?]
și puteți încerca să schimbați și
forma curbelor
și să modelați înseamnă că majoritatea
curbelor, toate curbele,
ar arăta foarte asemănătoare.
Și orice rămâne ca un
anormal după ce toate acestea au fost făcute,
este adevăratul tău lucru aberant, ceea ce ai
perceput ca un adevărat aberant.
Și în cele mai multe cazuri, de fapt,
asta are foarte mult sens
și oferă o
cauză diferențială
care poate fi coroborată prin
măsurători independente.
Aceasta este o problemă similară pentru
măsurarea cu microarray ADNc.
În acest caz, nu se așteaptă ca
rapoartele roșu versus verde
să prezinte
nicio dependență de intensitate.
Dar, în cele mai multe cazuri, când
faci microarray în două culori,
asta este ceea ce vezi.
Deci acestea sunt intensitatea
și acestea sunt rapoartele.
Și vezi că ceea ce te-ai
aștepta este o curbă ca aceasta
și asta este ceea ce vezi.
Aceasta înseamnă că
colorantul roșu și verde
nu sunt încorporați cu
aceeași eficiență,
mai ales în funcție
de concentrație
sau concentrație sau de
specia individuală de gene.
Așadar, ceea ce vedeți este
că pentru
genele cu număr redus de copii, să spunem, colorantul roșu
este încorporat cu o eficiență mai mare
decât cea verde.
Ceea ce faci în acest
caz este de fapt să
încerci să-l îndrepti,
pentru că presupunem
că [?  avem, ?]
pentru toate genele,
încorporarea roșie și verde
ar trebui să fie aceeași.
Deci ceea ce încercați
să faceți este să corectați
erorile sistematice.
Și în cazul în
care presupuneți
că presupunerea dvs. de bază este
că majoritatea lucrurilor nu se schimbă,
atunci puteți alege un set de
elemente care vor fi folosite.
Adică, uneori
există un set
de gene de menaj, care
este un concept foarte șocant.
Presupuneți că anumite
gene nu se schimbă - să
spunem că
genele metabolice nu se schimbă
sau
proteinele structurale, genele
asociate cu
proteinele structurale nu se schimbă.
Acum, acest lucru este folosit
foarte des, după cum sunt
sigur că ați văzut, în [INAUDIBIL]
este că [INAUDIBIL]
uită vârsta sau
[?  actina.  ?] Ei bine, e în regulă.
Este foarte dificil să găsești
un set de gene care
nu este de așteptat să se schimbe.
Sau puteți alege un set
de gene de control speciale
care, dintr-un motiv oarecare,
nu se modifică niciodată
în sistemul dumneavoastră.
Și, desigur,
atunci, următorul pas
este trebuie să determinați
funcția de normalizare, care
este o medie globală sau o
normalizare mediană,
sau o parte dintr-o
[?  interdependenţă ?]
normalizare.
Dacă doriți să aflați
mai multe despre asta, atunci, de fapt,
există un întreg site web
și o cameră de chat și altele.
Și există o întreagă
industrie de cabană
care încearcă să-și dea seama
care este cea
mai bună modalitate de a
normaliza un microarray?
Alternativa este
ca dacă vii
cu o idee despre cum
este generată de fapt eroarea.
Deci acesta este cel mai
popular model de eroare,
în care se presupune
că la concentrații scăzute,
aveți o eroare admisă.
Aveți pur și simplu
un zgomot alb în
jurul măsurătorii.
La concentrații mari,
aveți o eroare multiplicativă.
Și de fapt, pentru tot zgomotul,
ai combinația
celor două.
Deci, dacă faceți
aceste ipoteze,
atunci puteți genera
modele de eroare foarte bune.
Și normalizarea
bazată pe aceasta
vă oferă de fapt un
rezultat foarte similar
cu ipoteza anterioară.
Deci, de fapt, aceste
două metode, se pare,
sunt interschimbabile, cel
puțin pentru microarray ADNc.
Zgomotul va limita conținutul de
informații utile
al măsurătorilor.
Aceasta este problema.
Acesta este motivul pentru care trebuie
să poți livra asta.
Deci, se pare că dacă luați toate
aceste măsurători cu microarray,
atunci o detectare fiabilă
a două sau patru diferențe
pare să fie limita practică.
Deci, aceasta este de fapt o comparație
foarte optimistă și nu pe
mai multe platforme.
Deci, dacă faceți un număr mare
de măsurători Affymetrix
în tot felul de --
sau micromăsurători ADNc,
sau un număr mare
de mostre de cancer foarte, foarte diferite
, atunci se
pare că dacă luați
toate informațiile - sau toate
informațiile utile  ,
extrageți
toate informațiile utile
din măsurătorile dvs. --
deoarece există o
diferență de două ori -- o
detectare fiabilă a
diferenței de două ori --
este aproape
limita, este posibil
ca anumite gene să fie
măsurate în mod fiabil,
cu  precizie mai mare.
Dar pentru toate
genele, probabil, aceasta
este limitarea experimentală.
Și de ce este o
problemă importantă?
Din nou, revenind
la problema pe care
încercați să preziceți cum se
va comporta sistemul dvs.,
să presupunem că
doriți să vă dați seama
cine reglementează pe cine, începând
cu măsurătorile în serie de timp.
Deci, veți măsura
modificările expresiei genelor sau
modificările proteinelor într-un
anumit interval de timp.
Deci, cum ați proiecta
experimentele dvs.?  Au
fost experimente
făcute pe ciclul celular
al drojdiei sau al fibroblastelor umane.
Dar, desigur, trebuie să-ți
alegi momentul corect.
Deci, dacă aceasta este eroarea
măsurătorii dvs., această linie continuă,
atunci, desigur, nu
doriți să faceți măsurători
mai des decât vă permite eroarea de
măsurare a experimentului
.
Deci, dacă știți cât de
repede se schimbă genele
și care este eroarea dvs. experimentală
, din asta,
puteți determina o
fereastră de timp sensibilă și sigură,
ceea ce pare să fie cazul
că, de exemplu, în drojdie,
nu are rost să luați mai mult
[?  geno-spacial?] măsurători
mai des decât la fiecare
5 până la 10 minute,
iar în celulele de mamifere mai
des decât 15 până la 30 de minute.
Dacă măsurați mai
des,
pur și simplu veți
întâlni zgomot
și doar
irosești banii.
Deci, acesta este motivul pentru
care trebuie să fii
conștient de limitările de zgomot.
Și când știi care
este eroarea sau zgomotul
măsurătorii tale, poți să
faci câteva calcule din spate
despre câte
informații poți
extrage de fapt din acea
măsurătoare și
pentru ce ar putea fi suficientă.
Deci, trecând la cealaltă
problemă a sensibilității
și completitudinii, când
încerci să prezici ce se
va întâmpla cu
sistemul tău, atunci, desigur,
întrebarea este că
există un compromis
sau există această problemă
a modului în care  câți parametri
măsurăm și câți
parametri ar trebui să măsurăm?
Dacă încerci să prezici
dacă o anumită celulă va...
un anumit cancer va
metastaza sau nu, de
câte gene
ai nevoie pentru asta?
Dacă doriți să preziceți
cum va progresa un ciclu celular
, câte gene
trebuie să măsurați pentru asta
și câte măsurăm?
Deci, pentru asta, trebuie să avem
cel puțin o impresie despre cât de
mari sunt aceste rețele.
Deci asta arată doar
că este destul de mare.
Aceasta este o reprezentare grafică
a tuturor proteinelor care interacționează
din drojdie.
Deci, în acest caz, aveți
aproximativ 5.000 de proteine.
Proteinele, genele,
modificările proteinelor
sunt toate
reglementate independent, așa că le puteți numi
ceva de genul bionoduri.
Si [?  precaut?] estimarea
ar fi că pentru fiecare celulă,
numărul de
noduri bio va
fi de ordinul
a, să spunem,
câteva sute de mii.
Acest lucru vine din
faptul că
aveți 10.000 până la 20.000 de
gene active per celulă
și aveți, să
spunem, mai puțin de 10
modificări post-traducere
per genă, per proteină.
Și asta ți-ar oferi
aproximativ acest număr.
Desigur, asta ar putea fi
mult mai mult și mult mai puțin
în ceea ce privește dacă
lucrați cu variante de îmbinare
sau dacă trebuie de fapt să
măsurați pe modul,
activitatea modulelor.
Dar aceasta este probabil
în această ordine
pentru a avea o imagine atât de completă.
Acum, cu siguranță
nu avem asta până acum,
dar așa s-a
dezvoltat tehnologia.
Și de fapt, acesta pare a fi cel
mai ușor lucru de realizat.  Pur și simplu
treceți la tot mai multe și
mai multe gene, mai ales pe măsură ce
proiectele genomului
sunt finalizate
și, probabil, acoperirea
cipurilor cu microarray de proteomică
va ajunge la
un genom complet
în următorii doi ani.
Nu există un motiv real pentru care
nu ar fi putut fi realizat.
Tot ce ai nevoie [?  a avea?]
este informația secvenței
și a configura tehnologia.
Dar astfel încât completitudinea poate
fi obținută în termeni de--
dacă muncești suficient de mult-- și
există zeci de mii
de biochimiști și
biologi care lucrează la asta--
poți măsura mai devreme sau
mai târziu majoritatea parametrilor
importanți biologic
ai celulei.
Cel puțin în
principiu, asta înseamnă
că poți avea o sondă
care să măsoare acest lucru.
Dar vedem de fapt
semnale care vin
de la acestea atunci când folosim
măsurători cu microarray?
Și era un domn,
[?  Michael?] [?  Holland,?]
care a făcut aceste experimente acum
câțiva ani,
când pur și simplu a făcut
măsurători cu microarray
și măsurători RT-PCR, de asemenea,
pe câteva gene din drojdie.
Și ceea ce l-a interesat
este, un lucru, unul,
care este intervalul dinamic de
modificări ale expresiei genelor în drojdie?
Și ce au descoperit este că
[?  transcriptom?] [INAUDIBLE]
în drojdie transportă variază peste
șase ordine de mărime.  De
fapt, asta înseamnă
că există o mulțime de gene.
Sunt o mulțime de celule.
[INAUDIBIL]
[?  pachete?] este foarte mare
și nu puteți vedea acest lucru în fiecare
celulă deoarece cel mai mic
număr înseamnă că există
0,01 copii pe celulă.
Deci, ceea ce vedeți este
că anumite gene,
anumite celule vor exprima
o singură copie a unei gene
din cauza zgomotului stocastic
și doar la fiecare 100 de celule
vor exprima asta.
Deci acesta este intervalul dinamic
al modificărilor expresiei genelor.
El a fost, de asemenea, interesat de
faptul că, dacă măsoară
nivelul de expresie genică a
acestor 300, 400 de gene
și a ales gene importante,
cum ar fi factorii de transcripție,
și compară
diferitele tehnologii --
RT-PCR este destul de sensibil,
deși la foarte, foarte
scăzut.  concentrații în care
întâlnești stocasticitate,
aceasta este probabil cea mai
sensibilă tehnologie pe care o
poți folosi.
Și
îl compari cu microarray,
atunci cât de sensibil este
microarray față de RT-PCR?
Și asta a văzut.
Și ceea ce vă arată,
că această gamă de
niveluri de expresie a genelor
este complet...
acest lucru nu este văzut de microarray.
Deci, aceasta este mult sub
sensibilitatea microarrayului.
Ceea ce vedeți este că
începeți să vedeți
o corelație între
măsurarea microarray
și RT-PCR la
două copii pe celulă.
Deci, toate aceste gene sunt de fapt
exprimate și în schimbare
și probabil că
fac ceva important.
După cum am spus, majoritatea
genelor au fost de fapt
factori de transcripție.
Dar ele nu sunt
văzute de microarray.
Deci, sensibilitatea este o
problemă foarte importantă atunci când
faceți măsurători cu microarray.  Ei
bine, atunci, în funcție
de tehnologia voastră,
veți avea o mulțime
de gene care
vor fi sub
sensibilitatea tehnologiei.
Sunt sigur că... și, vreau să spun, pe măsură ce
noile tehnologii apar
chiar acum, și acest lucru va
fi îmbunătățit.
Dar aceasta este o altă
problemă de care ar trebui să
fii conștient - că, chiar dacă
faci măsurători cu microarray
și vezi o mulțime de
puncte goale, nu
înseamnă neapărat că acele gene
nu se schimbă
sau nu sunt prezente.
Pur și simplu, măsurarea ta
nu este suficient de sensibilă.
Deci, cel mai mare obiectiv al
tehnologiei va fi,
desigur, o singură
măsurare, o singură copie-- îmi
pare rău-- pe o singură genă.
Dar chiar dacă măsurați
totul cu precizie,
ar putea exista probleme
cu predicțiile.
Și la asta mă
refeream înainte.
Și foarte repede, OK,
pentru că ești biolog,
cu mulți ani în urmă-- de fapt,
cred că s-a întâmplat aici la MIT--
un domn, Edward
Lorenz, încerca
să prezică cum se
va schimba vremea.
Era prin anii '60.
Și ceea ce a făcut a fost că a luat
câteva ecuații diferențiale obișnuite
, un
sistem complet determinist,
și a încercat să
prezică cum se va schimba rezultatul
acestui set de
ecuații diferențiabile.
Și ceea ce a fost cu adevărat
șocat să vadă --
și puțin mai târziu,
întreaga comunitate științifică
a fost șocată să vadă --
că aceste trei
ecuații diferențiale obișnuite
au produs un comportament
foarte sensibil
la condițiile inițiale.
Ceea ce înseamnă că dacă schimbați doar
puțin, doar
o mică parte din
parametrii de pornire,
rezultatul măsurătorilor
a fost complet diferit.
Și asta a ajuns în
istoria științifică ca teoria haosului,
unde s-ar putea să fi auzit
despre bifurcații și așa mai departe.
Ideea este că,
chiar dacă începeți
cu un sistem aparent complet
determinist, s-
ar putea să nu puteți
prezice cum se va comporta acel sistem
din cauza
acestui fapt -
că micile schimbări în
condițiile inițiale
pot provoca schimbări uriașe
ulterior.  puncte.
Acum, știm că
biologia nu este
așa pentru că biologia
este un sistem robust,
pentru că stăm
aici când vorbim.
Atât de mulți oameni cred că un
sistem biologic se află undeva
la marginea sistemelor complet
deterministe și haotice
.
Dar concluzia este
că doar pentru că
poți măsura totul
foarte precis,
nu
înseamnă neapărat că vei
avea o predicție foarte mare.
Dar permiteți-mi să vă dau o
reprezentare mult mai simplă
sau un exemplu a
aceleiași probleme.
Imaginați-vă că ați
măsurat deja foarte precis
nivelul de expresie a genelor -
și la o sensibilitate foarte mare -
a tuturor genelor, sau a multor gene,
într-o varietate de mostre de cancer.
Și ceea ce
încerci să-ți dai seama
este, care sunt genele
care provoacă cancerul?
Acum, să presupunem că ați găsit
acest subset de mostre de cancer
care... acestea sunt de fapt
măsurători reale din melanom.
Și acesta este... să spunem că
acesta este un subset de probe
care este extrem de malign, care
ucide pacientul foarte repede.
Și mai credeți
că ați găsit
un grup de gene
care vor fi
responsabile pentru acea
stare extrem de malignă.
Dar trebuie să
puneți întrebarea--
așa cum m-am referit la asta înainte-- se
poate datora
întâmplării, deoarece aveți
un număr limitat de mostre?
Ei bine, doar întâmplător,
dacă introduci aleatoriu
acele două valori,
poți vedea așa ceva.
Uneori poți găsi
o soluție analitică,
dar de cele mai multe ori nu poți.
Trebuie să faci un fel
de soluție de calcul.
Deci vă permutați setul de date
și căutați modele similare.
Și dacă nu găsiți niciodată un
model similar, un grup similar
de gene, în
matricea de expresie genică permutată,
atunci spuneți, ei bine, acest lucru
nu se datorează întâmplării.
Dar acest lucru nu este atât de
evident cum să o faci.
Deci soluții analitice
pot fi găsite uneori.
Așa că permiteți-mi să vă dau
acest exemplu foarte simplu.
Deci asta... de obicei
pun o problemă pe
care o poți rezolva acasă.  Am
avut această problemă că, la
începutul analizei microarray,
laboratorul meu a măsurat
măsurătorile expresiei genelor
în diferite
linii celulare de cancer de sân.
Și când am ajuns --
pentru că era
foarte scump --
când am ajuns la șase
linii de celule de cancer de sân,
am descoperit că 13
gene regulate greșit,
gene reglate în sus sau în jos.
Și ceea ce ne-am întrebat este dacă
asta se poate datora întâmplării sau nu?
Deci asta a fost tradus într-
o problemă de combinatorie
că aveți opt
linii celulare diferite într-un
microarray de gene, este numărul
de gene reglate greșit
în linia i-a de celule.
Și întrebarea a fost, putem
găsi [?  K ?] în mod consecvent
în gene reglate greșit
în toate aceste linii celulare
de către [?  şansă?  ?] Deci, dacă
vă place combinatorica,
acesta este un mic exercițiu drăguț acasă
dacă doriți să rezolvați.
Dar astfel încât să puteți găsi o
soluție analitică pentru asta.
Și acest lucru este foarte simplu.
Și acest lucru ar putea fi
rezolvat destul de ușor.
Și tu un
număr destul de de încredere din asta.
Dar dacă
sunt implicate mai multe gene?
Și mai important,
ce se întâmplă dacă genele nu sunt
reglementate independent?
Presupunerea de bază
în combinatorică
este că vă extrageți
mostrele în mod independent,
aleatoriu și independent.
Dar, în acest caz,
genele sunt co-reglate.
Dacă un
factor de transcripție este reglat în sus,
bine,
genele din aval vor
fi, de asemenea, reglate în sus
, sau unele dintre ele
vor fi reglate în sus.
Și asta provine
din mostre reale.
Deci ceea ce vedeți aici este că atunci când
faceți o permutare completă,
atunci aceasta va
fi distribuția
coeficienților de corelație
pentru fiecare pereche de gene.
Dar în mostre reale,
asta este ceea ce vedeți.
Deci, există o corelație ridicată
a modificărilor expresiei genelor în
sus și în jos,
ceea ce este oarecum evident, deoarece
aceasta este o rețea reglementată genetic
.
Acum, problema este că, dacă
trebuie să faceți această analiză
și puneți întrebarea,
modelul meu este aleatoriu sau nu,
sau poate fi prezent din cauza
întâmplării sau nu, ei bine,
dacă utilizați permutată, o expresie
genetică permutată aleatoriu
matrice
ca punct de referință,
apoi, în acest caz,
analiza dvs. sau rezultatul dvs.
sau analiza dvs. statistică poate
fi oprită cu ordine de mărime -
cu șase sau șapte
ordine de mărime -
în raport cu o
analiză în care spuneți,
ei bine, eu  Voi
permuta eșantionul,
dar voi păstra
dependența generală a modificărilor expresiei genelor
.
Dacă faci asta, ceea ce
nu este un lucru evident
și necesită niște
trucuri de calcul, acum
ai un
rezultat foarte diferit.
Zgomot în măsurători discrete.
Da?
PUBLIC: [INAUDIBIL]
ZOLTAN SZALLASI:
OK, deci ceea ce ai
este că ai găsit un model pe
care un anumit număr de gene
provoacă, să spunem, cancer.
Și ceea ce
fac oamenii de obicei este
o randomizare completă.  Să
presupunem că schimbi pe
toată lumea, pe toată lumea,
apoi cauți același
model și nu-l găsești.
Nu găsești niciodată cele
cinci gene care
ar prezenta același
model și ești fericit.
Acum, problema este că asta
a distrus complet... a
distrus această permutare,
codependența genelor.
Și, în realitate, asta înseamnă
că, dacă aveți codependență--
imaginați-vă că există anumite
gene care sunt foarte puternic
corelate și alte gene nu
sunt niciodată corelate--
că cele care sunt de
fapt corelate
nu sunt de fapt două
gene independente, ci în analiza dvs.  ,
asta ar trebui să fie unul, ai
putea înlocui gena [INAUDIBILĂ]
, nu?
Și asta ar
trebui să reții.
Bineînțeles, nu ai
coreglare completă și
independență completă, dar
ai o distribuție
a coeficienților de corelație.
Asta vezi aici.
Deci modul în care ar trebui să
facem acest lucru este să creați
un număr mare de
matrice aleatoare
în care distribuția
coeficienților de corelație
este ceva de genul acesta, dar în
afară de asta, este aleatorie.
Și apoi pune
întrebarea, modelul meu este
prezent și în asta?
Acum, dacă comparați
puterea statistică
sau încrederea statistică
dintre aceste două matrici,
puteți fi depășit cu cinci sau
șase ordine de mărime.
Deci ceva care este
semnificativ în asta
este mult sub
semnificație în asta.
Deci asta este ideea.
Nu este chiar atât de evident
cum să faci aceste lucruri.
Există doar un
punct important că
uneori, chiar dacă aveți
măsurători de bună calitate,
biologia vă va prezenta
probleme foarte dificile.
Și acest lucru este de fapt prezent
în măsurătorile secvențe.
Vreau să spun că întreaga
problemă BLAST este și despre asta.
Deci, trecerea la zgomot în
măsurători discrete,
care este cel mai bun exemplu.  Cel
mai simplu exemplu sunt
de fapt secvențele de ADN.
Deci, desigur, aveți

și acolo o eroare de măsurare.
Aveți erori de secvențiere
cu o anumită probabilitate.  Să presupunem că
acum
probabil că a scăzut la 0,1%,
dar folosești [INAUDIBLE]
între 0,1% și 1%.
Desigur, soluția a
fost [?  secvență?] [?  A ?]
[?  lot.  ?]
Desigur, dacă vedeți o
diferență în secvențierea dvs.
și nu este făcută cu
un singur individ,
nu sunteți foarte
sigur dacă
vedeți un polimorfism de un singur nucleotide
, un SNP
sau o eroare de secvențiere.
Dar dacă muncești
suficient de mult și secvenți suficient,
vei avea un fel de
sentiment despre adevărata subsecvență
a unei secvențe ADN.
Acum, ajungi cu o întindere foarte,
foarte, foarte lungă
de straturi.
În cazul oamenilor,
este de 3 miliarde.
Și ceea ce trebuie să obții --
sau ceea ce se așteaptă de la tine --
este să găsești gene,
introni, exoni,

locurile de legare a factorului de transcripție
în această mare de patru litere.
Acum, cum faci asta?
Aceasta va fi
și o problemă de zgomot.
Dacă ați avea doar gene,
cum ar fi exoni și introni,
sau numai exoni și
site-uri de legare a factorului de transcripție,
ar fi foarte ușor de găsit.
Problema este că
aveți o mulțime
de ADN nedorit sau
regiuni intergenice
și nu aveți idee ce
fac.
Și în acelea, uneori, informații
aparent inteligibile
vor
apărea doar întâmplător.
Deci, cum poate fi găsit?  De aceea,
adevărata
modalitate de a construi genomuri
nu este doar secvențierea ADN-ului,
deoarece, din acest motiv,
este foarte greu de
găsit numărul de gene.
De fapt, dacă te uiți cu atenție în
literatura de specialitate despre numărul
de gene, de obicei,
numărul de gene
continuă să scadă cu timpul,
deoarece, de fapt, ei
văd că există o mulțime
de predicții eronate.
De obicei, acești
algoritmi de predicție a genelor
tind să greșească pe partea
care ți-ar da...
pe o latură mai liberală.
Are tendința de a vă oferi mai multe
gene decât este prezent în realitate.
Deci ceea ce căutați
este de fapt ADNc--
de exemplu, biblioteci de ADNc,
pentru același organism,
pentru că acestea sunt
genele cu adevărat exprimate.
Așa că încercați să reuniți
cele două baze de date diferite.
Și dacă găsiți un
ADNc, ei bine, acel ADNc
vă poate ajuta să găsiți
genele reale.
Acum, problema este că
cADN-ul trebuie exprimat.
Și dacă nu s-a întâmplat să
pregătiți un ADNc din
linia celulară în care acea genă
este exprimată, ei bine, atunci
nu veți avea acea genă
în biblioteca voastră de ADNc.
Prin urmare, nu
îl puteți găsi în genomul dvs.
Deci, cum se poate găsi?
Și aceasta,
informațiile despre secvența ADN,
poate fi rafinată în mare
măsură de tot felul
de baze de date diferite,
surse de date.
Dar există o mulțime de
probleme neașteptate în biologie
care sunt cu adevărat uimitoare.
Sunt complet neașteptate
și nu ați fi
putut niciodată să veniți cu
acea idee pur și simplu bazată
pe informațiile secvenței primare.
Și cred că vă voi oferi doar
două date cu adevărat șocante,
care sunt de fapt
destul de rezonabile.
Una este apariția pe scară largă
a transcripției antisens
în genomul uman.
De ce primesc... ce
fac tipii ăștia, sau de ce?
Este o poveste lungă, dar ceea ce au
descoperit, de fapt,
ei au găsit în
genomul uman aproximativ 1.600 de

unități de transcripție antisens transcrise efectiv.
Deci știi, de obicei,

cum este citit și
descris genomul în sensul sensului?
Poate că doar analizând
dacă lucrurile
sunt transcrise într-un
mod antisens.
Adică ai învățat multe.
Adică, ai învățat multe despre
microARN, ARN reglator SiRna.
Deci, a existat un motiv bun pentru care se
uitau la asta.
Nimeni nu s-ar fi
așteptat să
existe un număr atât de mare de
unități de transcripție antisens reale.
De asemenea, când un grup a
verificat ce
porțiune a unui anumit cromozom
este de fapt transcrisă, au
fost surprinși
să vadă că
era cu un ordin de
mărime mai mult decât se aștepta.
Ceea ce fac oamenii de obicei este să
iei un cromozom --
în cazul în care verifică
cromozomul 21 și 22 --
știi unde sunt majoritatea
exonilor sau intronii
și, pe baza asta,
te aștepți că cei mai mulți... ei
bine, exonii
vor  să fie transcrise și poate
câteva ARN-uri reglatoare.
Deci, aveți o așteptare
ca, să spunem,
o pereche din cromozomul dvs.,
dintr-un anumit cromozom, să
fie transcris.
Acum, ceea ce au descoperit
când au
acoperit de fapt întregul cromozom
cu o formă asimetrică
este de fapt de 10 ori mai
multă informație
transcrisă din ADN
decât se aștepta pe baza exonilor.
Din nou, va trebui să
preziceți acest lucru pur și simplu pe
baza
informațiilor din secvența primară.
Dar ce poți face?
Ai această mare de informații
care pare a fi zgomot.
Deci există vreo modalitate
de a face față asta?
Deci, să presupunem că trebuie
să găsiți un
site de legare a factorului de transcripție.
Va fi ceva de
genul T-G-G-A-C-T.  Desigur,
nu știți că acesta este
T-G-G-A-C-T.  Și, desigur,
nu este întotdeauna T-G-G-A-C-T.
Poate fi T-G-C-A-C-T
deoarece
site-urile de legare a factorului de transcripție le place să se joace cu
secvența.
Și, de fapt, acesta
este modul în care își
pot schimba afinitatea cu
data lor -- sau specificitatea
secvenței lor date.
Deci, aceasta va
fi secvența ta reală la
care se poate lega.
Acum, asta este ceea ce vei
ajunge.
Acesta este ceea ce cauți și
nu știi
că acesta este site-ul tău obligatoriu.
Și încerci
să adaugi constrângeri.
Deci acesta este un truc.
Spuneți că
situsurile de legare a factorului de transcripție sunt de obicei
în 500 de perechi de baze în
amonte de codonul de început
al unei anumite gene.
Și știți, de asemenea, că tinde
să se grupeze în aceeași regiune.
Deci, pentru majoritatea
site-urilor de legare a factorului de transcripție.
Ai mai mult de unul.
Deci, ceea ce ați putea
face este să spuneți,
eu caut
anumite
secvențe lungi de șase perechi de baze, să zicem,
care tind să se grupeze în 500 de
perechi de baze de A-T-G.
Și atunci vei
găsi ceva.
Dar totuși, acest lucru va
fi foarte, foarte slab.
Aveți mult mai multe litere, mult
mai multe informații și mult mai mult
zgomot din care, atunci --
acela -- decât nivelul
de la care puteți extrage
informațiile importante.
Deci, chiar dacă faceți
toate acestea, veți
descoperi că multe alte

secvențe [INAUDIBILE] de legare a factorului de transcripție
nu funcționează ca atare.
Pai de ce?
Nu prea
înțelegem încă să facem
la un nivel mai înalt de ADN
[?  regularizare, ?] whatnot.
Și, desigur, problema
este că nu știi
cu ce secvență să începi.
Deci ce poți face?
Puteți spera că
reprezentarea dvs. statistică vă
va ajuta.
Și un truc este, desigur,
oferit de natură, care
este conservarea între specii.
Deci, ai genomul extrem de
zgomotos-- noi îi numim „zgomotoși”,
dar desigur,
nu sunt zgomotoși--
genoame extrem de zgomotoase--
uman, cimpanzeu, șoarece, șobolan, drojdie și
așa ceva.
Și presupuneți - și
această presupunere este o presupunere corectă -
că aveți o
conservare între specii
a secvențe importante.
Deci, ceea ce
căutați, există secvențe
care sunt conservate
în mai multe specii?
Și dacă combinați toate acestea
cu unele dintre instrumentele inteligente,
cum ar fi folosirea
inteligenței artificiale,
învățarea automată, HMM,
modelele Markov ascunse,
au fost extrem de utile de
găsit din identificarea genelor [INAUDIBILE]
,
atunci s-ar putea să începeți
să vedeți câteva modele care apar.
Și acest lucru a fost făcut pentru drojdie
de [?  grupul lui Alexandru ?].
Deci, acesta vă oferă doar
un exemplu concret
care a arătat că acesta este
de fapt o modalitate foarte eficientă
de a merge.
Când au secvențiat
specii de patru ani -
patru
specii de drojdie secvențiate foarte strâns înrudite -
numărul mediu de gene în
fiecare dintre ele a fost de aproximativ 5.500.
Motivul pentru care au făcut-o este
pentru că știau că acestea
sunt specii foarte asemănătoare.
Deci, ceea ce au descoperit
este că, de fapt,
există un nivel foarte ridicat de
[INAUDIBILE] de gene.
Deci, ceea ce au descoperit
este că acest lucru arată
că aceeași genă este prezentă
în aceeași locație în toate
aceste specii.
Ordinea se schimbă,
uneori gena se pierde, se
câștigă, mai ales fie
cromozomii din jurul telomerilor,
fie regiunile subtelomerice, există
o mulțime de turbulențe.
Dar pentru majoritatea
cromozomilor, lucrurile
sunt... sau informațiile sunt
reținute în mare măsură.
Desigur, există o
evoluție lentă și rapidă.
Ei au descoperit că pentru anumite
gene foarte importante,
există o conservare 100% a
nucleotidelor
la toate speciile.
Pentru alții, există un
nivel foarte scăzut de conservare.
Probabil că este
ceva cu care natura își
poate permite să experimenteze.
Dar concluzia este că ceea ce
făceau ei este, de fapt, că au
descoperit că

site-uri importante de legare a factorului de transcripție vor
fi prezente în aceeași
locație pentru toate speciile.
Deci, ceea ce
căutau aici este --
de fapt, acesta este un
loc de legare [INAUDIBIL] --
și vă arată cele
patru specii diferite
și arată că acesta este în
aceeași locație
în toate speciile diferite.
Acesta este [INAUDIBIL],
site-ul de legare [INAUDIBIL].
Este un alt tip de cutie.
Deci arată că aveți
o conservare foarte ridicată
a
informațiilor importante de reglementare.
Acum, ceea ce poți face este să
întorci asta și să cauți
informații necunoscute.
Deci ceea ce faci este... ceea ce au
făcut ei a fost să generăm -
sau au generat toate
secvențele aleatoare, care a fost XYZ.
Asta înseamnă că X, Y și
Z reprezintă oricare dintre A-T-C,
A-T-C-G și [?  A-T-C, ?] și
există orice număr de
A-T-C aleatorii între ele,
între 0 și 21.
Puteți face acest lucru.
Aceasta este în domeniul
calculului științific.
Acest lucru nu este de fapt
[INAUDIBIL]..
Deci acestea sunt orice combinație.
Și cauți anumite modele
semnificative statistic
pentru acestea.
Una dintre ele este
conservarea intergenică.
Există
secvențe ca aceasta,
când parcurgeți
toate secvențele, care
tind să fie conservate între
gene și regiunile intergenice?
Puteți verifica
conservarea intergenică versus conservarea genică
sau puteți verifica conservarea în amonte
versus conservarea în aval.
Acestea sunt toate
reperele statistice pe care le-au
găsit pentru site-urile cunoscute de
legare a factorului de transcripție
.
Deci, ceea ce au descoperit, că pentru situsurile
cunoscute de legare a factorului de transcripție
, toate acestea au...
acestea sunt mai conservate
în conservarea intergenică.
Aveți o conservare intergenică versus genică mai mare

și conservare în amonte versus
aval.
Deci, amintiți-vă problema.
Începi cu
orice secvență aleatorie.
Încercați doar să vă dați
seama că oricare
dintre aceste secvențe aleatorii au
vreo semnificație biologică.
Acum, și mai
important, ceea ce au
descoperit este că atunci când
începi să găsești

secvențe reținute sau conservate în mod semnificativ statistic,
atunci aceste motive
au fost, de asemenea, aranjate
în fața genelor care
aveau tendința de a împărtăși funcția,
ceea ce este foarte important.
Pentru că
presupui că
există anumite
module funcționale, așa că genele
care tind să facă
același lucru trebuie să
fie pornite sau
dezactivate în același timp
sau în aceleași condiții.
Așa că atunci au
venit cu o listă lungă
de
site-uri potențiale de legare a factorului de transcripție,
în care toate aceste lucruri
au fost reunite.
Și au descoperit că
acestea sunt secvențe
care tind să fie conservate
în fața genelor
care tind să împărtășească funcția.
Și multe dintre acestea au fost de fapt
confirmate independent
de experimente ca noi prin intermediul site-urilor de
legare a factorului de transcripție
.
Deci, concluzia este că
în aceste măsurători, chiar și
în măsurători discrete,
această secvențiere -
va trebui să
înfrunți mult zgomot.
Organismele biologice au fost
construite cu mult timp în urmă,
iar planurile s-au pierdut.
Dacă ai ști cum a
fost construit, atunci
ai putea să-ți dai seama ce este
important sau nu,
dar totul a fost
experimentat cu mult timp în urmă.
Așa că acum vi se pare
că, în acest moment,
informațiile importante sunt
ascunse într-o mare de
informații irelevante.
Și va fi foarte
dificil - și de obicei, este
imposibil - de găsit
doar pe baza de calcul.
Dar dacă cauți ajutor
de la biologia actuală --
în acest caz,
conservarea între specii -- ei bine,
atunci lucrurile importante,
pepitele de aur, încep să apară.
OK, și atât.
Alte intrebari?